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    生物通首頁 > 今日動態 > 專題總匯 > 熱點關注——m6A甲基化研究指南


           最近關于m6A甲基化的研究,熱度持續不減。那么,什么是m6A?如何檢測m6A?整體研究思路如何?大牛們又是怎么做的?想必大家都想了解一下。聯川生物近日重磅推出m6A研究的技術專題,覆蓋m6A的技術介紹、研究思路和案例解讀,值得您細細品讀。




    m6A概念,重磅前沿

           在真核生物中,5’端的Cap以及3’端的ploy A修飾在轉錄調控中起到了十分重要的作用,而mRNA的內部修飾則用于維持mRNA的穩定性。mRNA最常見的內部修飾包括N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羥基化(m5C)等。

           當RNA分子腺苷酸上第六位氮原子處發生甲基化時,就是我們所說的m6A。雖然RNA甲基化的研究在上世紀七十年代就開始,但是由于技術上的局限一直停滯不前。直到最近幾年在何川教授等研究團隊的帶領下,通過不斷的技術創新和難點攻克,m6A 等甲基化修飾的研究才不斷取得突破性的進展。詳細內容>>

    延伸閱讀:
    RNA堿基修飾以及m6A的前世今生
    m6A甲基化酶的種類及功能盤點



    如何檢測m6A?

           2012年,兩篇發表于《Nature》和《Cell》上的論文可以說是第一次從轉錄水平上高通量地鑒定了人和小鼠m6A的甲基化水平(Dominissini 2012和Meyer 2012)。這兩篇獨立發表的論文采用的核心方法是將m6A抗體與帶有m6A的mRNA片段相結合后進行高通量測序。通過對下機數據的分析來鑒定mRNA上m6A程度較高的區域,分辨率約為100 nt。這種方法我們稱之為MeRIP-seqm6A-seq

           2015年,部分科學家將m6A的分辨率精確到單堿基的程度,包括miCLIP-seqSCARLET等(Linder 2015和Fu 2014)。這類方法雖然可以鑒定單堿基的甲基化水平,但由于實驗方法中涉及P32等同位素標記加上成本過高,常規實驗室不會特意展開此類實驗。

           這里主要對MeRIP-seq這項技術的原理做一個簡述,方便大家理解如何對m6A區域進行富集和鑒定。文末我們還會對一些實驗中比較“坑爹”的雷區,展開討論。備注部分將會詳細討論可能出現問題的一些環節,這個部分需要重點關注。詳細內容>>

    延伸閱讀:
    m6A甲基化檢測方法及優劣勢盤點



    手把手教你如何開展m6A實驗

           關于m6A甲基化的研究,目前有多種思路可供選擇。無論是前期開展預實驗還是申請基金,都可以根據下圖中的研究流程圖展開。下面,我們就以小陳同學的實驗為例,帶領大家如何一步步開展自己的實驗,身臨其境地去體驗m6A實驗的每個階段所要完成的步驟。詳細內容>>



    延伸閱讀:

    m6A甲基化的整體研究思路:m6A課題如何設計
    m6A甲基化的整體研究思路:m6A相關SCI論文發表要求分類匯編



    后期驗證工具

           你以為做完m6A測序就結束了?當然不是。做完測序后需要對分析結果中感興趣的內容進行生物學功能驗證,一個完整的功能驗證將歷經分子細胞→細胞功能→動物實驗等形成完整的實驗思路。其中分子細胞包括RNA-RNA互作驗證(如miRNA與UTR互作驗證)等。細胞功能包括敲低/敲除/過表達、蛋白細胞定位、蛋白與蛋白互作、蛋白與RNA/DNA互作、細胞表型實驗(遷移侵襲、劃痕、增殖、凋亡、周期)等。最后的動物實驗主要指動物模型實驗,如小鼠、斑馬魚等。首先,m6A-IP-qPCR了解一下!詳細內容>>

    延伸閱讀:
    RNA甲基化m6A后期驗證工具(一)
    RNA甲基化m6A后期驗證工具(二)



          案例解析1:

    論文標題:ALKBH10B Is an RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition
    刊登日期:2017年12月
    發表雜志:《Plant Cell》
    研究機構:北京大學賈桂芳/何川課題組

    在這篇論文中,北京大學的賈桂芳課題組利用擬南芥ALKBH10b(At4g02940)突變體研究去甲基化酶如何對擬南芥開花早期的成花轉變進行調控。結果顯示,ALKBH10b通過介導FT, SPL3和SPL9的去甲基化修飾,并且證實幼年期→成年期關鍵分子miR-156不參與調控該通路,而是ALKBH10b特異性地調控擬南芥成花轉變過程。詳細內容>>

    延伸閱讀:

    m6A調節果蠅性別分化和神經功能


          案例解析2:

    論文標題:m6A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition
    刊登日期:2017年2月
    發表雜志:《Nature》
    研究機構:美國芝加哥大學何川課題組

    在這篇論文中,來自芝加哥大學的何川教授課題組發現,胚胎中超過三分之一的母源mRNA上存在m6A修飾,這些mRNA之后會被YTHDF2清除。YTHDF2一旦被敲除后,帶有m6A修飾的母源mRNA的半衰期顯著上升,合子基因組激活受阻。這些胚胎無法及時啟動MZT,細胞周期發生中止從而導致斑馬魚子代發育延緩。詳細內容>>

    延伸閱讀:
    m6A調控miRNA初級體識別加工




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