論文標(biāo)題：N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing
刊登日期：2015年03月
發(fā)表雜志：Nature
影響因子：40.1
研究機(jī)構(gòu)：美國(guó)洛克菲勒大學(xué)
技術(shù)手段：m6A-seq，小RNA芯片，細(xì)胞敲低和過表達(dá)，qRT-PCR等

1.摘要

在miRNA生物合成的第一步是在微處理蛋白復(fù)合物的幫助下對(duì)初級(jí)microRNA（pri-miRNA）進(jìn)行加工。微處理蛋白復(fù)合物由RNA結(jié)合蛋白DGCR8和III型核糖核酸酶Drosha組成。這個(gè)起始事件需要DGCR8識(shí)別pri-miRNA發(fā)夾上莖和側(cè)翼單鏈RNA的連接處，并招募Drosha剪切雙鏈RNA產(chǎn)生前體miRNA（pre-miRNA）。pri-miRNA的加工機(jī)制已經(jīng)被闡釋，但是目前并不知道DGCR8在眾多具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本中識(shí)別和結(jié)合pri-miRNA的機(jī)制。

本研究中，洛克菲勒大學(xué)Dr.Tavazoie教授的課題組發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，METTL3會(huì)使pri-miRNA發(fā)生甲基化，標(biāo)記的pri-miRNA可以被DGCR8的識(shí)別和加工。通過miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，敲低METTL3會(huì)降低DGCR8與pri-miRNA的結(jié)合作用，引起成熟體miRNA表達(dá)量降低，通過未經(jīng)加工pri-miRNA含量增加。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)m6A會(huì)促進(jìn)pri-miRNA的加工。最后，功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)揭示METTL3能夠促使miRNA成熟。

本研究結(jié)果表明，m6A標(biāo)記是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后修飾，會(huì)促進(jìn)miRNA生物合成的起始。

2.METTL3直接介導(dǎo)pri-miRNA加工

這篇文章的作者在先前的研究中已經(jīng)證實(shí)，轉(zhuǎn)錄后的堿基修飾能夠調(diào)控miRNA的加工過程。作者通過FIRE算法在pri-miRNA中找到了高豐度GGAC motif。這種motif與許多已發(fā)表的文獻(xiàn)中METTL3識(shí)別的RGAC motif很相似。與很多pri-miRNA相反的是，這種motif并沒有在miRNA前體序列（pre-miRNA）中富集。

接下來為了證實(shí)這種現(xiàn)象是否與METTL3酶相關(guān)，作者對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231使用了m6A-seq（也叫MeRIP-seq）測(cè)序，在m6A靶向的pri-miRNA上發(fā)現(xiàn)了許多GGAC motif。根據(jù)m6A-seq結(jié)果搜尋順式調(diào)控元件發(fā)現(xiàn)METTL3 motif顯著富集。

此外作者使用IGV軟件發(fā)現(xiàn)，pri-miRNA上被reads覆蓋程度較高的區(qū)域基本都是METTL3的motif并用綠色的小點(diǎn)標(biāo)記了出來。

為了證實(shí)METTL3是否真的參與miRNA加工過程，作者在細(xì)胞系中使用兩種短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA）對(duì)METTL3進(jìn)行干擾并用control shRNA進(jìn)行對(duì)照，然后使用小RNA微流體芯片統(tǒng)計(jì)細(xì)胞中miRNA整體的表達(dá)情況。接下來作者發(fā)現(xiàn)miRNA成熟體整體表達(dá)量顯著下調(diào)。此外，METTL3敲低后對(duì)miRNA在基因組不同位置上的影響呈現(xiàn)一定的多樣性，內(nèi)含子比例最高，接下來是基因間區(qū)。

作者對(duì)幾個(gè)關(guān)注的miRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)受METTL3敲低影響，miRNA表達(dá)量顯著下調(diào)。

另外，METTL3敲低在多種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系中都存在相似的情況，即miRNA表達(dá)量都顯著下調(diào)。所有結(jié)果表明，METTL3無論在腫瘤細(xì)胞系還是常規(guī)細(xì)胞系中都對(duì)miRNA表達(dá)產(chǎn)生很大的影響。

為了驗(yàn)證METTL3是否真正影響miRNA加工，作者在細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入METTL3過表達(dá)載體。結(jié)果表明METTL3過表達(dá)能夠顯著提高細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)水平。

接下來作者發(fā)現(xiàn)METTL3敲低后，pri-miRNA表達(dá)量顯著上升。這個(gè)結(jié)果表明pri-miRNA加工成pre-miRNA和miRNA成熟體需要METTL3來介導(dǎo)參與。

所以無論是METTL3的敲除敲低，還是過表達(dá)后改變了其表達(dá)量、細(xì)胞中亞定位或微處理蛋白復(fù)合物的催化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明METTL3直接參與pri-miRNA的加工過程。

3.METTL3直接參與pri-miRNA的m6A甲基化修飾

為了證實(shí)METTL3直接參與pri-miRNA的m6A甲基化修飾，作者使用METTL3抗體紫外交聯(lián)法（CLIP-seq）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，與m6A-seq測(cè)序相似，METTL3 motif被顯著富集。

與m6A-seq測(cè)序結(jié)果相似，METTL3敲低/敲除后miRNA與METTL3 footprint存在極高的重疊率。

接下來作者采用Phastcons軟件對(duì)100多種脊椎動(dòng)物的miRNA以及METTL3 motif進(jìn)行分析，結(jié)果表明METTL3在不同動(dòng)物中都是極端保守的。

4.METTL3介導(dǎo)m6A修飾參與pri-miRNA加工

為了證明m6A修飾直接參與pri-miRNA的加工過程，作者獲得了轉(zhuǎn)染了DGCR8和DROSHA的HEK293細(xì)胞提取物。這些提取物被用于驗(yàn)證pri-miRNA是否含有m6A堿基修飾。通過Northern blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生甲基化的pri-let-7比未發(fā)生甲基化修飾的pri-let-7通過微處理蛋白復(fù)合物作用后產(chǎn)生pre-let-7的效率會(huì)更高。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說明m6A甲基化修飾對(duì)于pri-miRNA加工成pre-miRNA這一過程至關(guān)重要。

接下來，作者對(duì)pri-miRNA上容易發(fā)生m6A修飾的腺嘌呤苷酸（位于METTL3 motif中的A）進(jìn)行點(diǎn)突變。已知pri-let-7e上一共含有五個(gè)腺苷酸（A），作者分別將五個(gè)A全部進(jìn)行點(diǎn)突變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些被突變的METTL3 motif（也叫作腺嘌呤苷酸A）能夠顯著降低pri-miRNA加工成熟體miRNA的效率。

5.METTL3和DGCR8形成復(fù)合物參與pri-miRNA加工 

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明METTL3和DGCR8屬于蛋白復(fù)合物中的一部分。但是兩者相互作用需要RNA介導(dǎo)，在RNase消化酶的作用下，兩者不能相互結(jié)合。接下來作者想要驗(yàn)證DGCR8是否與發(fā)生m6A甲基化的RNA相結(jié)合，使用紫外交聯(lián)法分離出DGCR8。對(duì)DGCR8免疫共沉淀后，m6A免疫印跡法實(shí)驗(yàn)證實(shí)DGCR8確實(shí)能夠與發(fā)生m6A甲基化的RNA相互結(jié)合。對(duì)METTL3敲除/敲低后能夠顯著降低RNA甲基化水平從而降低DGCR8和RNA結(jié)合水平。但是，DGCR8與發(fā)生甲基化的RNA并不是直接相結(jié)合的，作者通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DGCR8與甲基化RNA和非甲基化RNA相結(jié)合并沒有偏好性。

6.DGCR8特異性識(shí)別m6A甲基化pri-miRNA

mRNA非常容易形成類似于pri-miRNA一樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)。為了證實(shí)DGCR8是否真正能夠特異性識(shí)別pri-miRNA而不是mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)這個(gè)猜想，作者想要通過降低pri-miRNA的m6A甲基化水平，從而驗(yàn)證DGCR8蛋白結(jié)合的RNA總量是否所有下降。接下來，作者對(duì)細(xì)胞中的METTL3進(jìn)行了敲除，并將所有的RNA進(jìn)行放射性標(biāo)記。DGCR8免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，METTL3敲除后DGCR8結(jié)合的RNA總量和pri-miRNA總量都顯著降低（放射性信號(hào)減弱）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，發(fā)生m6A甲基化的pri-miRNA能夠被DGCR8特異性識(shí)別，并影響后續(xù)成熟體miRNA的加工。

7.總結(jié)

本文通過上述一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，首次證明了m6A甲基化修飾是參與miRNA加工過程的一種新型調(diào)控方式。METTL3能夠?qū)�pri-miRNA上GGAC motif的腺苷酸（A）進(jìn)行m6A修飾。RNA甲基化修飾能夠促進(jìn)pri-miRNA被DGCR8特異性識(shí)別，從而成為miRNA成熟體加工過程中的一個(gè)十分重要的marker。所以作者認(rèn)為m6A是一種十分重要的RNA標(biāo)記，這種標(biāo)記能夠介導(dǎo)激活下游的微處理蛋白復(fù)合物，從而啟動(dòng)pri-miRNA向pre-miRNA和成熟體miRNA等一系列加工過程。因此m6A這種特殊的標(biāo)記在細(xì)胞核中具有重要的作用，即允許微處理蛋白復(fù)合物識(shí)別具有特定二級(jí)結(jié)構(gòu)且發(fā)生甲基化的pri-miRNA而不是其他一些底物如具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA等。此外，作者也推測(cè)METTL3的異常表達(dá)可能會(huì)引起腫瘤中miRNA的異常高表達(dá)。