今天的文章將圍繞RNA甲基化m6A后期驗證工具展開，詳細(xì)介紹了幾類高頻的驗證實驗，一起來學(xué)習(xí)吧~

前言

做完測序后需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進行生物學(xué)功能驗證，一個完整的功能驗證將歷經(jīng)分子細(xì)胞→細(xì)胞功能→動物實驗等形成完整的實驗思路。其中分子細(xì)胞包括RNA-RNA互作驗證（如miRNA與UTR互作驗證）等。細(xì)胞功能包括敲低/敲除/過表達、蛋白細(xì)胞定位、蛋白與蛋白互作、蛋白與RNA/DNA互作、細(xì)胞表型實驗（遷移侵襲、劃痕、增殖、凋亡、周期）等。最后的動物實驗主要指動物模型實驗，如小鼠、斑馬魚等。除了qPCR外，接下來的內(nèi)容中會選擇其中幾個高頻的驗證實驗做介紹。

細(xì)胞蛋白定位/免疫熒光實驗

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成的熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體或抗原作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受到激光的激發(fā)照射而發(fā)出明亮的熒光（紅色或綠色），就可以看熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原就抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

詳細(xì)protocol請查看： https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-3064-7_14 。驗證這類實驗可以大致觀察到一些重要的蛋白到底位于細(xì)胞核還是細(xì)胞質(zhì)中等結(jié)果。

蛋白與蛋白互作（免疫共沉淀和GST pull down）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation），簡稱Co-IP, 其原理是當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來, 如果用蛋白質(zhì)X的抗體anti-X（通常稱為IP抗體）將X特異地抓住并沉淀下來，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y或者Z等也能共同被沉淀下來。目前多用protein A/G預(yù)先固化在瓊脂糖或者磁珠beads上，protein A/G可以結(jié)合各種抗體，具有通用性，當(dāng)然它們結(jié)合不同種屬來源的抗體的親和力有差異，比如Protein A結(jié)合兔抗的結(jié)合力比G稍強, 具體需參考產(chǎn)品的說明書。因此利用Co-IP實驗可以（1）測定兩種甚至更多種蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；（2）鑒定一種特定蛋白質(zhì)的作用搭檔；（3）分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。具體Co-IP相關(guān)的protocol詳見： https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-62703-161-5_36 。

GST Pull-down

酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)分別克�。ㄈ诤希┑浇湍副磉_質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活域上，構(gòu)建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。

在此基礎(chǔ)上，GST pull-down實驗則是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗技術(shù)，近年來越來越受到廣大學(xué)者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。關(guān)于GST pull down以及其他蛋白-蛋白互作信息請查閱：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-60327-375-6_30 。

蛋白-RNA互作

RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點、RNA結(jié)合蛋白調(diào)控的靶基因等。RIP這種新興的技術(shù)運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等）。RIP實驗結(jié)束后富集到的RNA，既可以直接用于qPCR，也可用于芯片和測序?qū)嶒灥取�RIP詳細(xì)protocol請查看：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-6380-5_7。

表型分析（細(xì)胞功能學(xué)實驗）

細(xì)胞是生物有機體結(jié)構(gòu)和功能的最小單位，體外細(xì)胞實驗是文章的重要組成部分，目前細(xì)胞功能實驗主要有：細(xì)胞增殖，對細(xì)胞分裂的速度進行評價；細(xì)胞凋亡，是相對復(fù)雜的過程，反映細(xì)胞自身的狀態(tài)，此過程與疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系；細(xì)胞侵襲，反映的是腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移的能力；細(xì)胞周期，反映細(xì)胞的增殖速度以及細(xì)胞處在的分裂期。此部分實驗一般是對細(xì)胞進行特定基因的過表達或者干擾沉默后，研究細(xì)胞的功能變化，進而評價該基因在細(xì)胞內(nèi)的功能。

動物模型構(gòu)建

人類疾病的動物模型(animal model of human disease)是指各種醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的實驗動物。動物疾病模型廣泛應(yīng)用于疾病機制研究、新藥靶點發(fā)現(xiàn)及篩選、藥效評價、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域。目前實驗?zāi)Ｐ头譃榧膊∧Ｐ秃统闪瞿Ｐ汀＜膊∧Ｐ偷脑炷７椒ò�含藥物誘導(dǎo)、食物干預(yù)、手術(shù)等主流手段，造模后對主要的生理指標(biāo)進行檢測，保證模型的質(zhì)量和特異性。動物成瘤模型是目前最為廣泛應(yīng)用的、也是腫瘤在體研究中最為普遍的手段。

動物模型造模后會有一系列的指標(biāo)檢測保證模型特征性。腫瘤成瘤模型可以自行提供腫瘤細(xì)胞，也可以利用聯(lián)川生物細(xì)胞庫中的細(xì)胞進行成瘤。成瘤實驗一般需要進行預(yù)實驗驗證成瘤效果。

動物成瘤通常分為皮下成瘤和原位成瘤，一般步驟如下所示：

動物在體研究

動物在體研究包含病理研究和生理檢測，涵蓋動物病理解剖、組織石蠟切片制作、HE染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)檢測等。成瘤模型或者疾病模型造模成功后，可以直接做生理檢測并按要求取材做病理分析。需要注意的是動物在體實驗建議在SPF級實驗室完成。

今天的內(nèi)容講完啦，大家記得收藏好慢慢學(xué)習(xí)哦~

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