標(biāo)題：m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila
m6A調(diào)節(jié)果蠅性別分化和神經(jīng)功能
發(fā)表時(shí)間：2016年12月
發(fā)表期刊：Nature
IF：40.1
機(jī)構(gòu)：德國(guó)美因茨大學(xué)

1、前言

 RNA修飾在表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控中十分重要，其中m6A修飾在許多哺乳動(dòng)物中廣泛存在。許多真核生物中都存在m6A修飾，包括人、小鼠、斑馬魚(yú)甚至酵母。許多研究表明大量的m6A修飾落在了RRACH motif（R, purine; H, non-guanine base）內(nèi)，另外終止密碼子和3’ UTR區(qū)域也有大量的m6A修飾。RNA甲基化修飾參與許多轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，包括mRNA前體剪切，mRNA降解和翻譯，其中的“reader”酶YTH家族起到十分重要的作用。RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）能夠催化腺苷酸N6位發(fā)生甲基化，包括METTL3、METTL14、WTAP、Vir等。而去甲基化酶包括FTO和ALKBH5。

 已知在小鼠胚胎干細(xì)胞中將METTL3敲除（knockout）后能夠阻止其發(fā)生分化，MELLT3基因功能缺失對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的發(fā)育具有致死做用。同樣在果蠅中，METTL3的同源蛋白Ime4被敲除后也具有亞致死作用，由于NOTCH信號(hào)通路受損從而影響果蠅的生育能力。在模式植物擬南芥中，METTL3同源蛋白Ath-MTA被敲除后，其發(fā)育也會(huì)受到很大影響。另外，Ime4基因?qū)�酵母的減數(shù)分裂也有很重要的作用。種種跡象表明，m6A修飾對(duì)生物早期性器官發(fā)育以及早期的胚胎發(fā)育至關(guān)重要。近幾年的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，METTL3和METTL14會(huì)形成雜絡(luò)物行使催化作用，但是生物體內(nèi)的作用機(jī)制至今仍然未知。參與RNA甲基化的酶包括：

 昆蟲(chóng)整個(gè)生命周期包括胚胎期、幼蟲(chóng)期（一齡幼蟲(chóng)→三齡幼蟲(chóng)）、蛹期以及成蟲(chóng)期。作者先檢測(cè)了野生型果蠅各個(gè)時(shí)期的m6A整體的甲基化水平，使用質(zhì)譜法對(duì)Ime4、dMettl14和fl(2)d三種蛋白相對(duì)表達(dá)水平做了一個(gè)熱圖。從熱圖中我們可以發(fā)現(xiàn)在胚胎早期尤其是2小時(shí)后m6A水平處于一個(gè)很高的水平，之后開(kāi)始下降。在三齡幼蟲(chóng)期，m6A水平開(kāi)始上升，在蛹期又達(dá)到了一個(gè)高峰后逐漸下降。果蠅成蟲(chóng)期的頭部以及卵巢中m6A水平也一直維持相對(duì)較高水平。

 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，果蠅的METTL3同源蛋白Ime4有兩種密切相關(guān)的蛋白CG7818和CG14906。在果蠅的SR2+細(xì)胞（embryonic-derived Schneider）中敲低Ime4和CG7818后，m6A水平下降70%而敲低CG14906卻沒(méi)有任何影響。由于CG7818與METTL14結(jié)構(gòu)上具有很大的保守性和相似性，作者將CG7818重新命名為dMettl14。同樣fl(2)d和Vir基因與WTAP和KIAA1429高度同源，敲低后對(duì)果蠅的m6A水平也會(huì)產(chǎn)生較大的影響。

 在哺乳動(dòng)物尤其是人體內(nèi)中，RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14會(huì)形成雜絡(luò)物，而WTAP和KIAA1429也是重要的組成部分。在果蠅甲基化轉(zhuǎn)移酶中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了Vir、fl(2)d和Ime4。作者對(duì)果蠅的fl(2)d敲低后，Ime4和dMettl14的interaction顯著降低。

 基因定位實(shí)驗(yàn)表明參與m6A甲基化的酶都位于細(xì)胞核內(nèi)且都在胚胎早期發(fā)育階段處于高表達(dá)水平。另外胚胎晚期，這些酶在神經(jīng)外胚層也有較高的轉(zhuǎn)錄水平。

3.YT521-B介導(dǎo)m6A調(diào)控mRNA可變剪切

作者使用MeRIP-seq，從812個(gè)基因中鑒定了到了1120個(gè)m6A的peak。其中92%的peak都含有RRACH motif。此外，其他類(lèi)型的序列或motifs也含有較高的m6A水平，這表明這些motifs可能也對(duì)甲基化轉(zhuǎn)移酶具有特異性。

 此外，與其他真核生物類(lèi)似，在果蠅體內(nèi)start codon和stop codon區(qū)域存在很高的m6A甲基化修飾。

 接下來(lái)，作者針對(duì)SR2+細(xì)胞系中與m6A相關(guān)的各種酶敲低后進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，這些酶包括Ime4、CG6422、dMellt14、YT521-B以及Fl(2)d。從上圖a中我們可以明顯看到，MA-plot顯示不同敲低條件下，SR2+細(xì)胞系中的基因表達(dá)發(fā)生了顯著的差異（p<0.05）。圖b表示不同敲除條件下三個(gè)生物學(xué)重復(fù)基因表達(dá)的spearman相關(guān)系數(shù)表。圖c則是剪切模式的spearman相關(guān)系數(shù)表。

 其中作者發(fā)現(xiàn)Fl(2)d敲低后效果最為明顯，超過(guò)2000個(gè)基因表達(dá)顯著差異。敲低Ime4和dMettl14后，通過(guò)上面的韋恩圖可以發(fā)現(xiàn)SR2+中差異表達(dá)基因數(shù)量小于Fl(2)d（milder effects）。

 GO功能富集分析表明，這些差異表達(dá)的基因涉及各種功能如陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞粘附等。盡管SR2+細(xì)胞系并不是直接起源于神經(jīng)系統(tǒng)，但是許多差異基因都富集到了neuronal functions上，如axon guidance和synapse activity。

 通過(guò)表達(dá)量盒形圖發(fā)現(xiàn)，基因較低組的細(xì)胞中整體表達(dá)水平顯著高于control組。接下來(lái)，對(duì)SR2+細(xì)胞系中的Ime4和dMettl14這2個(gè)基因進(jìn)行雙敲低（double knockdown）。韋恩圖顯示至少15%的基因都有m6A的peak。

 Ime4和dMettl14雙敲后，m6A甲基化水平仍然發(fā)生了輕微但是仍然顯著的差異。這個(gè)結(jié)果表明每個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能擁有獨(dú)立的m6A peak位點(diǎn)。

 文章還發(fā)現(xiàn)在基因剪切事件上，雙敲的結(jié)果與2種酶單獨(dú)敲的結(jié)果低還是存在顯著差異的。在任意一種酶的敲低實(shí)驗(yàn)中，fl(2)d這個(gè)基因都行使十分重要的作用。通常情況下，不同酶敲低都會(huì)對(duì)基因5’的剪切以及內(nèi)含子保留等行為產(chǎn)生影響，這種情況同樣也存在于人細(xì)胞系中。

 YTH家族蛋白是一種十分重要的reader酶。果蠅中，CG6422和YT521-B屬于YTH家族的同源蛋白。蛋白細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明CG6422位于細(xì)胞質(zhì)中，受精后在胚胎期2小時(shí)達(dá)到最大值，接下來(lái)持續(xù)下降并且在幼蟲(chóng)期和蛹期一直維持較低的水平。然而，蛋白細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明YT521-B位于細(xì)胞核中，并且在胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)成蟲(chóng)的大腦中處于較高的轉(zhuǎn)錄水平。

 使用點(diǎn)印記法（dot-plot）和pull down實(shí)驗(yàn)表明，YT521-B能夠與RNA上的m6A位點(diǎn)相結(jié)合。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明，敲低CG6422后，差異基因RNA剪切事件幾乎影響不大。但是敲低YT521-B后，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明有103個(gè)基因的剪切事件差異顯著。韋恩圖顯示YT521-B與common target以及CG6422交集不到30%。所以這些證據(jù)都表明YT521-B在pre-mRNA剪切上行使極其重要的功能。

4.m6A甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)果蠅的行為調(diào)控

 為了尋找m6A相關(guān)酶的潛在功能，作者分別構(gòu)建了Ime4和dMellt14敲除的果蠅。

 其中針對(duì)Ime4這個(gè)基因使用兩種方法敲除方法，Ime4Null（CDS全部敲除）和Ime4Cat（C端保留催化結(jié)構(gòu)域）。文章發(fā)現(xiàn)無(wú)論是純合果蠅還是發(fā)生雜合突變的果蠅，幼蟲(chóng)都能羽化存活至成年期。卵巢中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何encapsulation defects。

 但是突變型果蠅壽命變短，飛行和爬行受阻，無(wú)法合翅。盡管突變型果蠅能夠勉強(qiáng)合翅伸縮翅膀，但是很難將翅膀合攏在腹部和胸部的背面。另外dMettl14基因突變型果蠅雖然翅發(fā)育正常，但是行為能力卻已經(jīng)缺失。為了驗(yàn)證Ime4和dMettl14是否在果蠅體內(nèi)能夠相互補(bǔ)償，作者構(gòu)建了雙突變果蠅和單基因突變果蠅。結(jié)果表明，這2個(gè)基因功能相似調(diào)控的通路也相似，可能調(diào)控common targets。此外，Ime4似乎在功能上比dMettl14更占優(yōu)勢(shì)，大部分催化反應(yīng)需要甲基化轉(zhuǎn)移酶有特定的催化結(jié)構(gòu)域。

 小貼士：果蠅屬于昆蟲(chóng)綱雙翅目，只有一對(duì)翅膀，另一對(duì)翅膀已經(jīng)進(jìn)化成平衡棒，用于輔助平衡飛行。通常翅膀會(huì)合攏在胸部和腹部的背面。

 行為實(shí)驗(yàn)表明Ime4突變型果蠅爬行速度顯著低于野生型果蠅，定向能力（Orientation）也出現(xiàn)問(wèn)題。種種證據(jù)表明m6A修飾通過(guò)調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)，從而嚴(yán)重影響果蠅的行為。為了通過(guò)表型行為探究深層的神經(jīng)缺陷和分子機(jī)制，作者在Ime4突變型果蠅幼蟲(chóng)中進(jìn)行了肌肉神經(jīng)接頭測(cè)試（NMJ）。上圖顯示NMJ在Ime4突變型幼蟲(chóng)內(nèi)樹(shù)突生長(zhǎng)是野生型的1.5倍。結(jié)果表明Ime4通過(guò)控制NMJ的樹(shù)突生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)果蠅幼蟲(chóng)的爬行行為。

 為了鑒定果蠅行為的靶基因，作者對(duì)二日齡雌果蠅成蟲(chóng)的頭部進(jìn)行了解剖并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析，作者在Ime4突變型中鑒定了1600多個(gè)差異基因在基因剪切模式上發(fā)生改變。這些差異基因絕大部分都是控制果蠅行為的。接下來(lái)作者又對(duì)SR2+細(xì)胞系原有的MeRIP數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大部分調(diào)控果蠅行為的基因都發(fā)生了m6A甲基化修飾。作者推測(cè)，甲基化轉(zhuǎn)移酶缺陷的情況下，可能有不止一個(gè)基因調(diào)控果蠅的行為。

5.甲基化修飾m6A調(diào)控果蠅性別分化

 在果蠅體內(nèi),sxl基因這個(gè)開(kāi)關(guān)激活與否由上游的劑量補(bǔ)償效應(yīng)來(lái)調(diào)控控制果蠅的性別分化，果蠅性別分化機(jī)制詳見(jiàn)下面小貼士部分。文章內(nèi)，作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ime4對(duì)Sxl影響很大。Sxl基因在雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)中同時(shí)存在，只不過(guò)雄蟲(chóng)Sxl基因有一個(gè)額外插入的外顯子。在突變體雄性果蠅基本不受Ime4的影響，而兩種突變型雌性果蠅在基因型上都表現(xiàn)出與雄性果蠅共有的外顯子插入以及雌雄果蠅獨(dú)有的剪切模式。無(wú)論是雌蟲(chóng)還是雄蟲(chóng)，Sxl不同轉(zhuǎn)錄本下降水平不是特別明顯，這表明m6A可能在大腦中特異性富集。

 Sxl基因下游調(diào)控的2個(gè)基因tra和msl也發(fā)生了顯著變化。這表明甲基化轉(zhuǎn)移酶可能會(huì)影響Sxl基因的pre-mRNA的剪切，從而影響果蠅性別分化和劑量補(bǔ)償效應(yīng)。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，作者使用Ime4雜合突變的雌蟲(chóng)與Sxl雜合突變的雄蟲(chóng)進(jìn)行雜交，統(tǒng)計(jì)后代存活率發(fā)現(xiàn)后代雄蟲(chóng)不受影響，Ime4與Sxl缺失的雌性大幅度下降。所以結(jié)果表明，Ime4破壞了果蠅體內(nèi)正常的劑量補(bǔ)償效應(yīng)，并通過(guò)調(diào)控Sxl影響雌雄果蠅的存活。

 小貼士：果蠅(左)和家蠅(右)在控制性別分化上采用完全不同的機(jī)制。2017年Science刊登論文首次鑒定了家蠅雄性決定基因Mdmd。果蠅通常采用補(bǔ)償劑量機(jī)制（dosage compensation），即當(dāng)上游的X:A的常染色體和性染色體比例決定下游的Sxl是否會(huì)被激活。如果Sxl基因受到影響，無(wú)論上游的X:A染色體比例如何，果蠅都會(huì)發(fā)育成雄性成蟲(chóng)。相反，如果Sxl一直處于激活狀態(tài)，則果蠅會(huì)發(fā)育成雌性成蟲(chóng)。

6.YT521-B缺失與m6A表型之間的關(guān)系

 鑒于YT521-B能夠特異性識(shí)別m6A甲基化位點(diǎn)，從而影響SR2+細(xì)胞中絕大部分由m6A介導(dǎo)的RNA剪切事件，作者對(duì)各種參與RNA甲基化的酶進(jìn)行了敲除（knockout）實(shí)驗(yàn)。YT521-B缺失能夠引起不同轉(zhuǎn)錄本表達(dá)異常，而YT521-B突變果蠅雖然能夠存活至成蟲(chóng)期，但是飛行等行為受到了很大的影響。
 

 將YT521-B突變雌蟲(chóng)與Ime4突變雌蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)各自有243和397個(gè)基因存在剪切模式的差異。5’端可變剪切位點(diǎn)特異性不高，內(nèi)含子部分保留仍然較多。顯然，YT521-B突變也能影響male-specific Sxl，從而影響下游的tra和msl-2，繼而使得雌蟲(chóng)體內(nèi)female-specific Sxl轉(zhuǎn)錄水平降低。以上結(jié)果表明m6A甲基轉(zhuǎn)移酶是通過(guò)YT521-B調(diào)控果蠅行為和性別分化。

7.Nito是一種全新的參與m6A修飾的酶

 為了探究YT521-B的調(diào)控機(jī)制，作者利用SILAC技術(shù)，對(duì)SR2+細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的氨基酸進(jìn)行同位素標(biāo)記，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和免疫共沉淀對(duì)SR2+細(xì)胞中和YT521-B免疫結(jié)合的蛋白進(jìn)行定量分析。幾乎一半（n=30）與預(yù)測(cè)的結(jié)合蛋白相符合。為了驗(yàn)證其中是否存在m6A介導(dǎo)的剪切事件，我們分別對(duì)這30個(gè)蛋白進(jìn)行了depleted，然后評(píng)估fl(2)d對(duì)剪切事件的影響。其中蛋白Hrb27C、Qkr58E-1和Nito與fl(2)d控制的剪切現(xiàn)象相符合。

 分析了6個(gè)額外的m6A介導(dǎo)的剪切事件表明，Hrb27C和Qkr58E-1僅僅調(diào)控一個(gè)蛋白亞基，而Nito的缺失會(huì)導(dǎo)致基因剪切時(shí)間異常，這個(gè)異常現(xiàn)象與YT521-B及其蛋白復(fù)合物功能缺失后的現(xiàn)象比較相似。

 接下來(lái)作者使用免疫共沉淀將YT521-B與Hrb27C、Qkr58E-1和Nito三種結(jié)合蛋白進(jìn)行共沉淀探尋蛋白間的相互作用。結(jié)果表明，Hrb27C和Qkr58E-1與YT521-B的結(jié)合依賴(lài)于RNA。

 而Nito蛋白與YT521-B蛋白相結(jié)合則完全不依賴(lài)于RNA。但是Nito蛋白與Ime4以及fl(2)d相結(jié)合依賴(lài)于RNA。Nito基因的敲低會(huì)導(dǎo)致m6A修飾水平的降低。因此Nito缺失對(duì)于m6A的水平影響很大。該研究還鑒定到了果蠅m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的新亞基Nito(Spenito)。