論文標(biāo)題：ALKBH10B Is an RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition
刊登日期：2017年12月
發(fā)表雜志：Plant Cell
影響因子：8.68
研究機(jī)構(gòu)：北京大學(xué)賈桂芳/何川課題組

前言

目前國(guó)內(nèi)外大部分RNA甲基化研究都集中在基礎(chǔ)生物學(xué)與醫(yī)學(xué)方向，而關(guān)于植物RNA甲基化的研究仍然偏少。2014年何川/賈桂芳課題組在Nature Communications上發(fā)表研究，利用m6A-seq首次對(duì)擬南芥RNA甲基化進(jìn)行了報(bào)道。另外中科院北京基因組研究所以及西北農(nóng)林科技大學(xué)也分別在RNA Biology及Genome Biology上利用m6A-seq對(duì)水稻和擬南芥的不同組織部位進(jìn)行研究。

擬南芥中已鑒定了大量RNA甲基化酶，如METTL3同源基因MTA、METTL14同源基因MTB、WTAP同源基因FIP37以及KIAA1429同源基因Virilizer。去甲基化酶包括ALKBH9A, ALKBH9B, ALKBH9C, ALKBH10A以及ALKBH10B等。其中MTA介導(dǎo)擬南芥胚胎后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，F(xiàn)IP37與MTA互作，是甲基化酶復(fù)合物重要組成部分。

在本文中，賈桂芳課題組利用擬南芥ALKBH10b（At4g02940）突變體研究去甲基化酶如何對(duì)擬南芥開花早期的成花轉(zhuǎn)變進(jìn)行調(diào)控。結(jié)果顯示，ALKBH10b通過(guò)介導(dǎo)FT, SPL3和SPL9的去甲基化修飾，并且證實(shí)幼年期→成年期關(guān)鍵分子miR-156不參與調(diào)控該通路，而是ALKBH10b特異性調(diào)控?cái)M南芥成花轉(zhuǎn)變過(guò)程。最后論文通過(guò)RNA甲基化測(cè)序m6A-seq挖掘了1000多個(gè)基因發(fā)生了差異甲基化修飾，這些基因直接或間接受到了ALKBH10b的影響。

論文框架與流程

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALKBH10b行使去甲基化作用

作者先使用BLAST算法，把人源ALKBH5酶與擬南芥的幾種酶進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，列出了五個(gè)候選酶：ALKBH9A, ALKBH9B, ALKBH9C, ALKBH10A和ALKBH10b。結(jié)果顯示，ALKBH10b在擬南芥幾乎所有組織中表達(dá)豐度都很高，而且在花期表達(dá)量最高。ALKBH9B和ALKBH9C這兩種酶的豐度緊接其后。

作者在下一步使用ALKBH9B和ALKBH9C兩種擬南芥突變體來(lái)驗(yàn)證m6A修飾水平，結(jié)果表明mRNA甲基化水平并無(wú)明顯變化。所以作者選定ALKBH10b作為后續(xù)的研究目標(biāo)。

接下來(lái)作者分別結(jié)合使用了煙草瞬間轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以及純化后的ALKBH10b來(lái)研究去甲基化酶在體外的修飾現(xiàn)象。LC-MS/MS分析表明，m6A甲基化水平在體外降低了50%。

最后作者將ALKBH10b行使催化活性關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域上的氨基酸殘基H366A/E368A進(jìn)行突變后，ALKBH10b的去甲基化修飾活性被破壞。此外作者還比較了人源ALKBH5在同等條件下與ALKBH10b是否在催化能力上相似。結(jié)果表明，ALKBH10b比ALKBH5在催化ssRNA上活性略低，而具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的structured RNA兩者并無(wú)明顯差別。另外ALKBH10b只對(duì)m6A有特異性去甲基化催化功能，而m1A則沒(méi)有催化功能。

帶有m6A甲基化修飾的mRNA為ALKBH10b的底物

為了在擬南芥體內(nèi)驗(yàn)證ALKBH10b的功能，作者構(gòu)建了2個(gè)突變體：alkbh10b-1（ALKBH10B FeII結(jié)合位點(diǎn)前外顯子插入T-DNA）和alkbh10b-2（ALKBH10B預(yù)測(cè)α-KG結(jié)合位點(diǎn)前內(nèi)含子插入T-DNA）。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明alkbh10b-1幾乎不產(chǎn)生任何ALLBH10b的轉(zhuǎn)錄本，而alkbh10b-2只產(chǎn)生不到5%的轉(zhuǎn)錄本。

當(dāng)去甲基化酶ALKBH10b催化功能被破壞后，RNA整體的m6A/A的比例開始升高（即甲基化水平上升）。接下來(lái)作者進(jìn)行補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)（rescue）對(duì)alkbh10b-1和alkbh10b-2進(jìn)行了ALKBH10b的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，擬南芥表型得到補(bǔ)救恢復(fù)到野生型但alkbh10b-1補(bǔ)救效果比alkbh10b-2要更優(yōu)。在野生型中過(guò)表達(dá)ALKBH10b（35S），甲基化水平也是顯著下降。

作者對(duì)其他幾種甲基化轉(zhuǎn)移酶如MTA、MTB、FIP37等進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯差異。表明ALKBH10b直接參與RNA的去甲基化修飾，使得擬南芥m6A水平發(fā)生變化且與甲基化轉(zhuǎn)移酶無(wú)關(guān)。

已經(jīng)有大量的研究，尤其是動(dòng)物中，核糖體RNA、tRNA等也存在可逆化甲基化修飾和去甲基化修飾。但是最后作者在擬南芥中證實(shí)，rRNA和tRNA并不受ALKBH10b的調(diào)控，且ALKBH10b也不會(huì)對(duì)其他類型的堿基修飾如m1A、m5C、m1G等有去甲基化的修飾作用。

所以ALKBH10b的底物不具有廣譜性，既不會(huì)對(duì)rRNA、tRNA上的m6A有去甲基化修飾作用，也不會(huì)對(duì)其他修飾如m1A等有催化功能。

ALKBH10b影響擬南芥成花轉(zhuǎn)變和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)

作者對(duì)alkbh10b-1突變體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀察后發(fā)現(xiàn)，野生型在展開第12片真葉（true leaves）后開花，而alkbh10b-1則花蕾綻放前額外多出了7片真葉。相反的是，在野生型中過(guò)表達(dá)ALKBH10b在產(chǎn)生7片真葉后提早進(jìn)入花期。在alkbh10b-1突變體中進(jìn)行ALKBH10b補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)，可對(duì)alkbh10b-1中原本ALLBH10b產(chǎn)生缺陷的表型進(jìn)行補(bǔ)救，從而恢復(fù)到野生型的表型水平。然后，針對(duì)alkbh10b-1進(jìn)行ALKBH10b H366A/E368A（即催化結(jié)構(gòu)域被突變的ALKBH10bm）的補(bǔ)救后，發(fā)現(xiàn)表型依舊沒(méi)有恢復(fù)到野生型水平。最后作者得出結(jié)論ALKBH10b功能缺失后成花轉(zhuǎn)變延后，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)受到抑制。

ALKBH10b介導(dǎo)去甲基化修飾提升開花關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平

已知FT基因（Flowering Locus T）參與擬南芥葉片光周期、葉片春化、赤霉素和衰老通路。在alkbh10b-1突變體中，F(xiàn)T基因表達(dá)量顯著降低，花期延后。說(shuō)明ALKBH10b能夠調(diào)節(jié)FT基因的豐度最終影響成花轉(zhuǎn)變。為了進(jìn)一步證實(shí)m6A甲基化修飾參與FT表達(dá)，作用使用了m6A-RIP-qPCR技術(shù)對(duì)FT甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，超過(guò)50%的FT在alkbh10b-1中發(fā)生了m6A甲基化修飾，而野生型中m6A修飾水平不到30%。此外，與FT基因相關(guān)的SPL3和SPL9在alkbh10b-1突變體中甲基化水平也是顯著提升，轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。通過(guò)m6A-RIP-qPCR技術(shù)對(duì)片段化的mRNA進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T基因Peak主要位于起始及終止密碼子，SPL3及SPL9的Peak主要位于3’ UTR區(qū)域。所以結(jié)合m6A-RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)不僅證明了ALKBH10b直接參與介導(dǎo)FT、SPL3和SPL9的去甲基化修飾，同時(shí)表明去甲基化修飾是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)水平的一種方式。

ALKBH10b維持FT, SPL3和SPL9的穩(wěn)定性并影響成花轉(zhuǎn)變

在哺乳動(dòng)物中，先前已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)YTHDF2作為reader可以對(duì)發(fā)生甲基化的mRNA進(jìn)行降解。為了在擬南芥中證實(shí)這種猜想，作者開展了兩項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)FT基因在整個(gè)生命周期中的降解情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控：a. 在轉(zhuǎn)錄水平最高的白天Z16期前使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D（actinomycin D）監(jiān)控FT的轉(zhuǎn)錄水平；b. 在夜晚Z16后檢測(cè)FT的降解水平。兩種方法同時(shí)證實(shí)在alkbh10b-1突變體中FT降解速度比野生型擬南芥更快。這個(gè)現(xiàn)象表明，當(dāng)擬南芥中甲基化水平提升時(shí)，mRNA會(huì)加速降解。當(dāng)在alkbh10b-1中進(jìn)行ALKBH10b過(guò)表達(dá)時(shí)，F(xiàn)T甲基化水平降低，mRNA維持穩(wěn)定性（即不被快速降解）。

已知miR-156調(diào)控SPL基因。賓夕法尼亞大學(xué)的Scott教授與浙江農(nóng)林大學(xué)的吳剛教授首次發(fā)現(xiàn)miR-156是控制植物幼年向成年階段轉(zhuǎn)變的主控因子，并揭示了控制該發(fā)育進(jìn)程的信號(hào)通道。但是在本次實(shí)驗(yàn)中，作者證實(shí)miR-156并不參與調(diào)控SPL3和SPL9。這表明SPL3和SPL9轉(zhuǎn)錄水平下降與miR-156沒(méi)有關(guān)聯(lián)。所有結(jié)果均表明去甲基化酶ALKBH10b能夠維持FT、SPL3和SPL9 mRNA的穩(wěn)定性。

FT、SPL3和SPL9的高甲基化水平能夠加速降解，而FT的缺失導(dǎo)致花期延后。在葉片中，SPL9能夠激活miR-172從而調(diào)控花期，而SPL3能夠直接與FT的啟動(dòng)子相結(jié)合。在alkbh10b-1中miR-172成熟體和前體數(shù)量均顯著下降。所以SPL3和SPL9因?yàn)楦呒谆�化修飾�?dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平下降，使得FT和miR-172受到抑制，從而導(dǎo)致成花轉(zhuǎn)變延后。
 
ALKBH10b缺失導(dǎo)致擬南芥整體m6A修飾水平降低

作者使用了m6A-seq和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等手段，通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合分析最終發(fā)現(xiàn)在野生型擬南芥中的9210多個(gè)基因挖掘到了12922多個(gè)Peak；alkbh10b-1突變體的8000多個(gè)基因上挖掘12975個(gè)Peak。差異分析表明，alkbh10b-1中共鑒定到1190個(gè)基因存在1276過(guò)甲基化修飾Peak。m6A修飾主要位于TSS、TES以及3’ UTR和5’ UTR附近。本次測(cè)序結(jié)果，m6A Peak基本集中在RRACH motif內(nèi)。GO功能富集分析表明，差異基因基本與器官組織發(fā)育、生殖成熟及開花轉(zhuǎn)換等功能相關(guān)。這個(gè)結(jié)果與之前alkbh10b-1表型一致。

總結(jié)

這篇文章詳細(xì)闡述了去甲基化酶介導(dǎo)的m6A修飾可以維持與花期相關(guān)基因的mRNA穩(wěn)定性，從而影響下游通路基因功能，為植物發(fā)育的研究提供了新思路。