生物通報道：很少有發(fā)現(xiàn)能夠像CRISPR那樣在一夜之間改變整個領(lǐng)域。CRISPR-Cas原本是原核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，自從人們發(fā)現(xiàn)了Cas9的應(yīng)用潛力，這一系統(tǒng)迅速成為了炙手可熱的基因組編輯工具。加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer A. Doudna在本期Molecular Cell雜志上發(fā)表文章，全面探討了CRISPR-Cas9在各方面的應(yīng)用。Doudna是CRISPR技術(shù)的共同開發(fā)者，曾因這一技術(shù)獲得了“生命科學(xué)突破獎”（Breakthrough Prize），也是CRISPR專利的有力競爭者。

CRISPR-Cas9基因組編輯

人們發(fā)現(xiàn)Cas9的分子功能之后，很快開始用Cas9和sgRNA編輯基因組。CRISPR-Cas9讓以往費時費力的基因組編輯變成了一件非常容易的事。

引入插入/缺失

Cas9在sgRNA的引導(dǎo)下，靶標(biāo)目的位點并誘導(dǎo)雙鏈斷裂DSB，細(xì)胞通過NHEJ（non-homologous end-joining）將其修復(fù)。NHEJ是一個容易出錯的修復(fù)通路，會產(chǎn)生插入/缺失（indel）破壞開放閱讀框，導(dǎo)致基因失活。CRISPR-Cas9在這方面的編輯效率可以高達80%。

精確的改變

HDR（homology-directed repair）可以讓CRISPR-Cas9的基因組編輯更加精確。將Cas9-sgRNA與供體DNA結(jié)合起來，細(xì)胞就能用供體DNA作為模板來修復(fù)DSB。這一策略可以向目的基因引入新序列或者特定突變，模擬或者矯正致病性的等位基因。不過HDR的效率顯著低于NHEJ。

染色體重排

用CRISPR-Cas9對模式生物進行基因組編輯已經(jīng)常規(guī)化了，人們又發(fā)現(xiàn)了一些更有趣的應(yīng)用。舉例來說，同時表達Cas9和多種sgRNA可以實現(xiàn)多重化靶標(biāo)。除了同時編輯多個染色體位點以外，CRISPR-Cas9還可以刪除染色體大片段，這需要兩個sgRNA在目標(biāo)區(qū)域兩側(cè)誘導(dǎo)DSB。此外，CRISPR-Cas9還可以模擬腫瘤中發(fā)生的大規(guī)模的染色體重排。

CRISPR-Cas9高通量篩選

最近有不少研究利用CRISPR-Cas9的可編程特性進行全基因組篩選。比如說，用慢病毒sgRNA文庫和催化活性的Cas9可以在人類和小鼠細(xì)胞中進行功能缺失的基因敲除篩選。這樣的篩選可以揭示細(xì)胞生存的必需基因，以及涉及特定藥物抗性的基因。

失去催化活性的Cas9 (dCas9)也可以用來進行全基因組篩選，它可以直接上調(diào)或者下調(diào)基因表達。與生成indel的活性Cas9相比，在某些情況下dCas9的轉(zhuǎn)錄沉默能夠更有效的阻斷基因表達。不過dCas9在這方面的最大優(yōu)勢是，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子的招募，進行功能獲得性篩選。

dCas9調(diào)控基因表達

通過點突變失活Cas9的催化活性位點，就會得到dCas9。dCas9依然可以在RNA的引導(dǎo)下，實現(xiàn)可編程的DNA結(jié)合。人們利用這一點開發(fā)了調(diào)控基因表達的新工具。

dCas9與sgRNA一起在細(xì)菌中表達，可以阻止RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，下調(diào)特定轉(zhuǎn)錄本的表達。人們還將dCas9與特定的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域融合起來，將轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子招募到特定的基因組區(qū)域，在真核生物中實現(xiàn)更強的基因表達控制。除此之外，將dCas9與帶有表觀遺傳學(xué)標(biāo)簽的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域融合，還可以特異性的干擾表觀遺傳學(xué)調(diào)控。

dCas9的其他用途

dCas9還有一些其它的用途：dCas9與GFP融合能夠在活細(xì)胞中成像DNA位點，進一步揭示基因組特定位置的動態(tài)和結(jié)構(gòu)。人們還可以通過dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控構(gòu)建穩(wěn)固的基因回路，這對于合成生物學(xué)來說非常實用。最近還有研究表明dCas9可以結(jié)合單鏈RNA，這意味著在不久的將來人們有望對RNA轉(zhuǎn)錄本進行編程操作。

提高CRISPR-Cas9特異性

為了減少CRISPR-Cas9的脫靶效應(yīng)，人們開發(fā)了一系列策略。研究者們用成對的sgRNA引導(dǎo)Cas9切口酶變體，在sgRNA結(jié)合的地方造成單鏈切口（SSB），兩個相鄰的單鏈切口會形成一個DNA雙鏈斷裂（DSB）。而單個sgRNA造成的SSB能通過堿基切除修復(fù)得到精確修復(fù)，不引入插入或缺失突變。（相關(guān)報道：Nature子刊：黃行許教授解決基因組編輯的脫靶問題）

研究者們還對Cas9進行了基因工程改造，讓其依賴二聚化才能酶切，就像鋅指核酸酶（ZFN）和TALEN那樣。研究顯示，dCas與Fok1核酸酶融合之后，DSB形成依賴于FokI的二聚化。二聚化酶對序列的要求更為嚴(yán)格，可以大大減少脫靶位點的數(shù)量。Cas9-FokI單體無法進行酶切。（相關(guān)報道：三篇Nature子刊：如何克服CRISPR的脫靶效應(yīng)）

人們還發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)截短sgRNA可以減少脫靶事件，同時不犧牲正確編輯的效率。只需要縮短gRNA靶標(biāo)區(qū)域的長度，就可以使脫靶突變大幅減少。研究表明，17/18個核苷酸的靶向區(qū)域能夠比全長gRNA更有效地靶向預(yù)定序列。（相關(guān)報道：Nature子刊：巧解基因編輯脫靶問題）

CRISPR-Cas9的未來

CRISPR-Cas9在醫(yī)療領(lǐng)域有著廣闊的前景，可以用來矯正致病突變，治療人類疾病。研究者們也在嘗試用這一技術(shù)操縱生態(tài)群體，比如根據(jù)毒力或者抗性基因殺死相應(yīng)的細(xì)菌、快速改變種群性狀、控制入侵物種、改良主要農(nóng)作物等等。此外，CRISPR-Cas9還有著很大的潛力，可以被改造為更強大的研究工具。Doudna指出，這一技術(shù)將帶領(lǐng)生物學(xué)研究進入一個新的時代。

生物通編輯：葉予

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