生物通報(bào)道：規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合，原本是細(xì)菌抵御病毒的重要武器，現(xiàn)在這一組合已經(jīng)成為了一個(gè)通用工具，被用于在真核生物中進(jìn)行位點(diǎn)特異性的基因組修飾。

引導(dǎo)RNA（sgRNA）是一段與目標(biāo)DNA片段匹配的短RNA，它負(fù)責(zé)指導(dǎo)CRISPR-Cas9的DNA剪切活性。人們發(fā)現(xiàn)，引入多個(gè)sgRNA可以同時(shí)修飾多個(gè)基因。CRISPR-Cas9在基因工程領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用潛力，吸引了眾多科學(xué)家的注意。

然而最近有研究顯示，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，CRISPR-Cas9會(huì)在相關(guān)位點(diǎn)引入不容忽視的脫靶突變。如果DNA片段與目標(biāo)片段的差異在五個(gè)核苷酸以下，就會(huì)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。這一問(wèn)題大大限制了該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。

南京大學(xué)和Wellcome Trust Sanger研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)，將Cas9 mRNA和sgRNA注射到小鼠胚胎后會(huì)引起脫靶突變。隨后他們利用Cas9切刻酶進(jìn)行了活體基因組編輯，成功將這種脫靶效應(yīng)最小化。這項(xiàng)研究于三月二日發(fā)表在Nature Methods雜志的網(wǎng)站上，通訊作者是南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所的黃行許教授，和Wellcome Trust Sanger研究所的William C Skarnes。黃行許教授還利用這一技術(shù)，對(duì)孿生的食蟹猴進(jìn)行了精確的基因編輯，文章發(fā)表在1月30日的Cell雜志上。

研究人員通過(guò)Cas9切刻酶進(jìn)行基因組編輯之后，又利用Ion Torrent公司的PGM測(cè)序儀，在小鼠胚胎和體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，對(duì)已知的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了深度測(cè)序。結(jié)果他們并未在這些位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)Cas9切刻酶引入的脫靶突變。

研究顯示，鋅指結(jié)構(gòu)的核酸酶（Cas9切刻酶）可以有效改善整個(gè)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的特異性。文章解釋道，因?yàn)榛�因組DNA中的切口可以被內(nèi)源的修復(fù)通路校正，所以Cas9切刻酶對(duì)基因組的危害非常小。研究人員指出，上述技術(shù)可以用來(lái)對(duì)任何模式生物或細(xì)胞模型進(jìn)行基因組編輯。

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作者簡(jiǎn)介：

黃行許：遺傳學(xué)教授、博士生導(dǎo)師

Email：huangxx@nicemice.cn ; xingxuhuang@nju.edu.cn

學(xué)習(xí)經(jīng)歷：1995年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，胚胎組織學(xué)碩士；1998年，廣州軍醫(yī)大，胚胎組織學(xué)博士；1998.9-2000.8，中科大生物物理所國(guó)家生物高分子實(shí)驗(yàn)室，分子生物學(xué)博士后研究；2000.8-2001.2，Houston大學(xué)，Anderson Cancer Research Center，細(xì)胞腫瘤學(xué)博士后研究；2001.2-2006.8，Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 分子遺傳學(xué)博士后研究。

研究興趣：1、建立不同基因工程小鼠模型研究配子發(fā)生的調(diào)控； 2、結(jié)合利用同源重組技術(shù)、鋅指蛋白酶技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、iPS技術(shù)進(jìn)行不同動(dòng)物的基因組改造。

生物通編輯：葉予

生物通推薦原文摘要：

Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects

Bacterial RNA–directed Cas9 endonuclease is a versatile tool for site-specific genome modification in eukaryotes. Co-microinjection of mouse embryos with Cas9 mRNA and single guide RNAs induces on-target and off-target mutations that are transmissible to offspring. However, Cas9 nickase can be used to efficiently mutate genes without detectable damage at known off-target sites. This method is applicable for genome editing of any model organism and minimizes confounding problems of off-target mutations.