生物通報(bào)道：規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合，原本是細(xì)菌抵御病毒的重要武器，現(xiàn)在這一組合已經(jīng)成為了一個(gè)通用工具，被用于在真核生物中進(jìn)行位點(diǎn)特異性的基因組修飾。

最近Nature Biotechnology雜志上發(fā)表了三個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的研究成果，研究人員深入分析了CRISPR的脫靶效應(yīng)，并提出了非常可行的解決之道。

CRISPR系統(tǒng)修改目的基因的簡(jiǎn)便性，讓幾乎所有實(shí)驗(yàn)室都有可能隨心所欲的進(jìn)行基因組編輯。你需要做的只是，在自己感興趣的細(xì)胞或生物中，表達(dá)Cas9內(nèi)切酶和引導(dǎo)RNA（gRNA）。引導(dǎo)RNA是一段與目標(biāo)DNA片段匹配的短RNA，它指導(dǎo)著CRISPR-Cas9的DNA剪切活性。

不過困擾其他定向核酸酶的老問題——脫靶效應(yīng)，也同樣影響著CRISPR系統(tǒng)。人們發(fā)現(xiàn)，Cas9會(huì)在基因組的一些脫靶位點(diǎn)進(jìn)行剪切。弗吉尼亞大學(xué)Mazhar Adli等人的研究顯示，在人類基因組中Cas9除了結(jié)合目的基因以外，還殃及了許多其他的位點(diǎn)。

Adli及其同事構(gòu)建了失去酶活性的Cas9（dCas9），并將其與12種不同的gRNA搭配。隨后他們通過ChIP-seq技術(shù)，在HEK293T細(xì)胞中檢驗(yàn)了dCas9在全基因組的結(jié)合情況。研究人員發(fā)現(xiàn)，脫靶結(jié)合的多少主要取決于gRNA。對(duì)于絕大多數(shù)gRNA而言，dCas9能結(jié)合幾十到幾百個(gè)脫靶位點(diǎn)（Kuscu et al., 2014）。研究顯示，具有酶促活性的Cas9的確會(huì)切割這些ChIP-seq鑒定的脫靶位點(diǎn)（盡管不是全部）。

這項(xiàng)研究告訴我們，CRISPR系統(tǒng)的特異性可能無法滿足某些應(yīng)用的需求。應(yīng)該怎么辦呢？Adli等人認(rèn)為，可以用Cas9 nickase代替野生型Cas9進(jìn)行基因組編輯。Cas9 nickase是一種突變型Cas9，只切割一條DNA鏈。（延伸閱讀：Nature子刊：黃行許教授解決基因組編輯的脫靶問題）

然而，哈佛大學(xué)David Liu研究組和麻省總醫(yī)院Keith Joung研究組找到了更好的辦法（Guilinger et al., 2014 and Tsai et al., 2014）。他們的策略是對(duì)Cas9進(jìn)行基因工程改造，讓其依賴二聚化才能酶切，就像鋅指核酸酶（ZFN）和TALEN那樣。二聚化酶有著更嚴(yán)格的序列要求，理論上應(yīng)該能夠大大減少脫靶位點(diǎn)的數(shù)量。

這兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)不約而同地將Fok1核酸酶融合到了dCas9的N端，與ZFN和TALEN中的方向相反。他們發(fā)現(xiàn)，融合而成的二聚酶與Cas9的正確切割效率相差不多。Liu和Joung兩個(gè)團(tuán)隊(duì)還通過深度測(cè)序，檢驗(yàn)了野生型Cas9的那些脫靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)二聚酶顯著減少了可檢測(cè)到的脫靶事件。

生物通編輯：葉予

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