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蛋白質(zhì)印跡出了問題？沒關(guān)系，下面的troubleshooting指南一定能幫助你找出可能的原因，并為你提供補救辦法。
1. 斑點（過濾）印跡
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癥狀 |
可能的原因 |
補救辦法 |
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樣品濾過膜的流速慢或無法濾過 |
真空不夠 |
確保印跡裝置已正確關(guān)閉，且密封完好。
確保真空源（如泵）運行正常。
用高品質(zhì)的實驗室膠帶密封所有開孔。提高真空水平。 |
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膜的孔被堵塞 |
離心或過濾樣品，以去除顆粒。
用緩沖液稀釋粘稠的樣品。 |
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在印跡上觀察到很少蛋白或無蛋白 |
上樣到膜上的蛋白質(zhì)不夠 |
最大限度減少樣品稀釋，過濾更多的樣品。 |
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去污劑（如SDS）可能抑制低分子量蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合 |
如有可能，去除去污劑。 |
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染色不夠靈敏 |
使用更加靈敏的染料。 |
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染色的印跡不均一 |
膜的結(jié)構(gòu)被濾紙壓縮 |
在印跡裝置中放置第二張膜，以保護接收樣品的膜。 |
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氣泡截留在膜的內(nèi)部 |
將膜放在甲醇表面，預潤濕膜。浸沒膜可能會截留空氣。 |
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膜未在甲醇中預潤濕 |
膜必須用甲醇預潤濕；整張膜應均勻地從不透明變?yōu)榘胪该鳌?/SPAN> |
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樣品中有氣泡 |
小心移液孔中的樣品，以避免氣泡形成。 |
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上樣量不夠 |
樣品必須覆蓋整個暴露的膜區(qū)域。 |
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膜上面的蛋白彌散 |
孔中的樣品滲漏 |
在過濾前確保印跡裝置正確組裝、關(guān)閉和密封。 |
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膜背面的蛋白彌散 |
超過了膜的容量 |
減少孔中的蛋白上樣量。 |
2. 半干轉(zhuǎn)印或槽轉(zhuǎn)印
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癥狀 |
可能的原因 |
補救辦法 |
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條帶彌散/扭曲 |
膜未在甲醇中均勻潤濕 |
整張膜必須用甲醇預潤濕；整張膜應均勻地從不透明變?yōu)榘胪该鳌?/SPAN> |
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膜下以及堆積層的其他各層之間存在氣泡 |
在組裝堆積層時，利用移液管或攪拌棒，輕柔滾動以去除任何截留的氣泡。 |
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凝膠和膜之間的接觸不均勻 |
確保整張凝膠和膜的表面有良好接觸。 |
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在轉(zhuǎn)印過程中產(chǎn)生太多熱 |
運行的溫度不應超過20°C。對于槽轉(zhuǎn)印，預冷緩沖液，或在冷室中開展轉(zhuǎn)印。對于半干轉(zhuǎn)印，要么縮短運行時間，增加濾紙數(shù)量，要么降低電流。 |
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在半干轉(zhuǎn)印過程中濾紙變干 |
在轉(zhuǎn)印之前確保濾紙徹底濕透，或使用更多濾紙。確保堆積層在15分鐘內(nèi)組裝好。 |
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蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印太快；蛋白質(zhì)累積在膜表面 |
降低電場強度。 |
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信號弱 |
蛋白質(zhì)穿過膜 |
將電壓降低最多50%，增加蛋白質(zhì)必須與膜接觸的時間。 |
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高負電荷的蛋白質(zhì)（由于天冬氨酸和谷氨酸含量高）往往在電場中非常快速地移動。降低電壓，以減慢這些蛋白質(zhì)的遷移。 |
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凝膠中SDS的存在可能抑制蛋白質(zhì)的結(jié)合。在轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡凝膠至少15分鐘。 |
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轉(zhuǎn)印緩沖液中甲醇濃度太低，不利于SDS的去除。將甲醇增加至15-20%，特別是對于較小分子量的蛋白質(zhì)。 |
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膜必須用甲醇預潤濕；整張膜應均勻地從不透明變?yōu)榘胪该鳌?/SPAN> |
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蛋白質(zhì)保留在凝膠中 |
如果轉(zhuǎn)印緩沖液中的甲醇濃度過高，它會去除蛋白質(zhì)中的SDS，導致蛋白沉淀在凝膠中。這會降低高分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。如果蛋白沉淀是個問題，那么可在轉(zhuǎn)印緩沖液中添加SDS（0.01%-0.05%），以提高溶解度。此外，過量甲醇往往收縮或收緊凝膠，從而抑制大分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。 |
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蛋白質(zhì)的等電點處于或接近轉(zhuǎn)印緩沖液的pH值 |
等電點與轉(zhuǎn)印緩沖液的pH值相同的蛋白質(zhì)將無凈電荷，因而不會在電場中遷移。為了促進轉(zhuǎn)移，嘗試更高pH值的緩沖液，如10 mM CAPS緩沖液（pH 11），包括10%甲醇，或較低pH值的緩沖液，如乙酸緩沖液。 |
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當凝膠和/或轉(zhuǎn)印緩沖液中使用尿素時，檢測不佳 |
通過循環(huán)的緩沖液設(shè)置，或在冷室中運行轉(zhuǎn)印，來降低溫度。尿素受熱會引起蛋白質(zhì)的氨基甲酰化，從而改變蛋白質(zhì)中氨基酸的電荷。這會影響抗體識別和結(jié)合所必需的表位。 |
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蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移不徹底 |
對凝膠染色，以檢查殘留蛋白質(zhì)。如果轉(zhuǎn)移不徹底，請檢查您的轉(zhuǎn)印技術(shù)。 |
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蛋白質(zhì)保留不佳 |
一旦轉(zhuǎn)印完成，確保膜徹底干燥，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的最佳結(jié)合和固定。這應在下游檢測之前完成。 |
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無信號 |
蛋白質(zhì)未轉(zhuǎn)移 |
檢查轉(zhuǎn)移過程中凝膠和膜的方向。使用預染的分子量標準品來監(jiān)控轉(zhuǎn)移。 |
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小分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移不佳 |
蛋白質(zhì)保留不夠，SDS干擾小分子量蛋白質(zhì)的結(jié)合 |
換用Immobilon®-PSQ轉(zhuǎn)印膜。去除轉(zhuǎn)印緩沖液中的SDS。 |
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轉(zhuǎn)印緩沖液中的甲醇濃度低 |
在轉(zhuǎn)印緩沖液中使用較高比例的甲醇（15%-20%）。 |
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蛋白質(zhì)結(jié)合的時間不夠 |
較低電壓可優(yōu)化小蛋白與膜的結(jié)合。 |
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電流不能穿過膜。 |
將膜和濾紙切成與凝膠相同的大小；切勿超出。 |
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大分子量蛋白質(zhì)（~ >80 kDa）的轉(zhuǎn)印不佳 |
甲醇濃度過高 |
甲醇濃度降低至10%（v/v）或以下能讓凝膠溶脹，從而協(xié)助大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。而且，較低比例的甲醇也會減少蛋白的SDS損失，減少凝膠中的蛋白沉淀。對于SDS對膜結(jié)合的干擾，>200 kDa的蛋白質(zhì)不如<100 kDa的蛋白質(zhì)靈敏。 |
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正電荷蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移不佳 |
蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液中帶正電荷；蛋白質(zhì)向陰極移動。 |
反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印堆積層，讓Immobilon® 轉(zhuǎn)印膜在凝膠的陰極一側(cè)。 |
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半干轉(zhuǎn)印不佳 |
電流繞過凝膠堆積層 |
確保膜和濾紙切成與凝膠相同的大小，切勿超出。 |
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各種大小的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移不佳 |
轉(zhuǎn)移大蛋白和小蛋白需要不同的條件 |
請參考“寬分子量范圍蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移可能需要多步的轉(zhuǎn)移”（T. Otter et al., Anal. Biochem. 162:370-377 (1987)）
在半干轉(zhuǎn)印中使用三緩沖液系統(tǒng)。 |
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