蛋白質(zhì)消化

這種方法介紹了固定在Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜上蛋白的制備，以便質(zhì)譜分析。
提示：質(zhì)譜兼容的膜染料包括考馬斯亮藍(lán)、氨基黑或Sypro印跡染料。

必需的設(shè)備和溶液
• 50%甲醇，溶于Milli-Q® 水中。
• 30%乙腈，50 mM碳酸氫銨
• 胰蛋白酶，溶解于Milli-Q® 水中，濃度為0.1 mg/mL。
• 80%乙腈，溶于Milli-Q® 水中。
• 真空過濾器。
• 微量過濾管。
• MALDI-TOF基質(zhì)。

步驟
1. 將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印操作，第35-38頁）。
2. 用考馬斯亮藍(lán)或氨基黑對轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行染色（操作2.3 通過不可逆染料觀察，第47頁）。
3. 用水清洗染色的膜，并干燥。
4. 用干凈的手術(shù)刀切下包含目的蛋白的膜，放入單獨(dú)的微量離心管中。
5. 用500 μL 50%甲醇對膜進(jìn)行脫色，室溫下脫色2小時。
6. 棄上清，讓膜干燥。
7. 加入10 μL 30%乙腈，50 mM碳酸氫銨和4 μL 0.1 mg/mL胰蛋白酶。
8. 室溫下過夜孵育。
9. 將上清轉(zhuǎn)移至干凈的微量離心管。
10. 用20 μL 80%乙腈超聲處理15分鐘，提取肽段。
11. 將提取物與之前的上清液合并。
12. 在真空離心管中干燥消化物。
注意：或者，使用默克密理博的ZipTip®SCX移液器吸頭來純化和濃縮肽段消化物，以取代干燥。若要使用此方法，用0.5% TFA（確保pH <3）酸化消化物，并按照ZipTip®SCX移液器吸頭的操作指南進(jìn)行（默克密理博刊物編號 P36444）。
13. 以少量30%乙腈、0.1% TFA重懸每個肽段提取物。
14. 將1-2 μL 消化物上樣到MALDI板上，并與1 μL基質(zhì)混合。

印跡保存

PVDF是一種耐化學(xué)性的聚合物，有著出色的長期穩(wěn)定性。對于那些需要保存以供日后使用的印跡而言，保存條件是由與膜結(jié)合的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性決定的。我們建議低溫保存，室溫對一些蛋白質(zhì)來說也足夠。

必需的材料
• 干燥的Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜。
• 兩張Whatman® 3MM濾紙。
• 兩張卡紙或薄的硬紙板。
• 回形針。
• 塑料袋。

步驟
1. 將干燥的印跡放在兩張干凈的Whatman® 3MM濾紙中間。
2. 將印跡-濾紙三明治放在兩張卡紙之間。
3. 用回形針夾住邊緣。回形針不應(yīng)與印跡重疊。
4. 將它們放入可密封的塑料袋中。
5. 關(guān)閉或密封塑料袋。
6. 將印跡保存在所需的溫度：
4°C 最多2周
20°C 最多2個月
70°C 長期保存

注意：保存在冰箱中的印跡不能受到機(jī)械振動，這會導(dǎo)致膜破損。印跡應(yīng)恢復(fù)到室溫后，才從塑料袋中取出。印跡也可放在塑料袋中，置于4°C，但應(yīng)加入疊氮化鈉等殺菌劑，以防止細(xì)菌生長。在使用之前，必須徹底洗掉疊氮化物，因?yàn)樗鼤�抑制HRP的活性。

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