下面介紹了兩種從印跡上去除抗體的操作。第一種適用于所有化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)，通過加熱和去污劑的組合來釋放抗體。第二種常用于抗體必須與抗原分離的應(yīng)用，它采用低pH值來改變抗體的結(jié)構(gòu)，通過這種方式處理后，結(jié)合位點(diǎn)不再有活性。

這兩種方法都不能去除顯色檢測系統(tǒng)所產(chǎn)生的有色沉淀（如BCIP、4CN、DAB和TMB）。不過，仍可以利用不同目標(biāo)蛋白的另一種抗體來分析印跡。

切記：在多次免疫檢測之間，印跡不能變干。如果它變干，任何殘留的抗體分子將永遠(yuǎn)與膜結(jié)合。

1 通過加熱和去污劑剝離

必需的設(shè)備和溶液
• 剝離溶液：100 mM 2-巰基乙醇，2%（w/v）SDS，62.5 mM Tris-HCl，pH 6.7。
• 磷酸鹽緩沖液（PBS）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
• 淺托盤，能容納膜。

步驟
1. 在通風(fēng)櫥內(nèi)，將印跡放入剝離溶液中，在50°C搖動孵育30分鐘。
2. 將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。重復(fù)一次，使用新鮮的緩沖液。
3. 可選：重復(fù)開始的檢測操作（省略一抗步驟），以確保抗體已失活或從膜上剝離。
4. 將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。
5. 繼續(xù)進(jìn)行封閉步驟，進(jìn)行下一輪的免疫檢測。

2 通過低pH值剝離

必需的設(shè)備和溶液
• 剝離溶液：25 mM 甘氨酸-HCL，pH 2，1%（w/v）SDS。
• 磷酸鹽緩沖液（PBS）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
• 淺托盤，能容納膜。

步驟
1. 將印跡放入剝離溶液中，搖動孵育30分鐘。
2. 將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。重復(fù)一次，使用新鮮的緩沖液。
3. 繼續(xù)進(jìn)行封閉步驟，進(jìn)行下一輪的免疫檢測。

3 利用ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit剝離

必需的設(shè)備和溶液
• 標(biāo)準(zhǔn)的印跡或印跡條，在硝酸纖維素或PVDF/尼龍膜上。
• 封閉液。
• 保鮮膜，以保存那些不立即再次雜交的印跡。
• 蒸餾水，用于試劑的稀釋。
• 塑料托盤，在剝離、清洗和封閉液中孵育印跡或印跡條時使用。
• 陽性和陰性剝離對照。

步驟
注意：印跡或單個印跡條若要重復(fù)使用，應(yīng)在第一次使用后立即剝離。如果不能立即剝離，將膜包在保鮮膜中，保存在PBS中，置于4°C。切勿干燥保存印跡。
1. 在塑料托盤中裝入適當(dāng)量的1X Antibody Stripping Solution（試劑盒中提供）。
2. 利用鑷子，將印跡或印跡條浸入剝離溶液中。輕柔混合，在室溫下孵育15分鐘。
3. 在一個干凈的塑料托盤中裝入相同量的封閉液。傳統(tǒng)的封閉液如20 mM Tris HCL，pH 8.0；150 mM NaCl；0.1% 吐溫20；5%奶粉或其他都可使用。

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