主題四：PacBio RS系統(tǒng)在靶向測(cè)序和臨床診斷中有何獨(dú)到應(yīng)用？

• SNP和Indel變異驗(yàn)證、廣義單倍體型分析

Mauricio Carneiro：

“任何儀器如果只有隨機(jī)誤差，那反而顯得太棒了、太完美了，因?yàn)槎鄿y(cè)幾次或者提高覆蓋度就可以把隨機(jī)錯(cuò)誤稀釋掉。所以當(dāng)其他人被PacBio的原始高錯(cuò)誤率嚇退的時(shí)候，我反而毫無顧慮。”

目前研究人員對(duì)于突變數(shù)據(jù)的驗(yàn)證一般采用Sequenom質(zhì)譜、Sanger測(cè)序法。雖然這兩種方法的準(zhǔn)確性很高，但是Sequenom方法對(duì)未知位點(diǎn)突變無法進(jìn)行檢測(cè)，且很多分析仍然需要借助人工方法，而Sanger測(cè)序法通量低、花費(fèi)大且同樣存在人工誤差的問題。此外采用多種測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行交叉驗(yàn)證也大大降低了效率，且產(chǎn)生新的突變類型導(dǎo)致更加復(fù)雜的分析。所以，最好是利用已有的測(cè)序平臺(tái)直接產(chǎn)生高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，最大程度避免其他方法的交叉驗(yàn)證。“基于這些考慮，我們對(duì)PacBio給予了厚望。隨著項(xiàng)目進(jìn)展，現(xiàn)在它已經(jīng)成為我們的標(biāo)準(zhǔn)工具。”

我們從千人基因組計(jì)劃產(chǎn)生的SNP數(shù)據(jù)中挑選了98個(gè)已經(jīng)用其他方法驗(yàn)證過的難測(cè)SNP位點(diǎn)，盡管之前沒人知道為什么這些位點(diǎn)那么難測(cè)，“但事實(shí)就是，這些位點(diǎn)在一般其他的測(cè)序儀上測(cè)的話總是一如既往地出錯(cuò)”，所以這些位點(diǎn)就成了測(cè)試測(cè)序儀性能的標(biāo)準(zhǔn)。我們分別利用PacBio平臺(tái)和Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PacBio數(shù)據(jù)有著更好的準(zhǔn)確性和假陽性檢出率，相對(duì)而言是一種更為有效的驗(yàn)證工具。

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)6、參考影像7/10、生物通往期文章1/2/3/10。

Matthew Meyerson：

Broad研究院正努力把PacBio做成基因分型、變異驗(yàn)證與重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平臺(tái)，并專門為PacBio開發(fā)了補(bǔ)充算法，用于糾正其隨機(jī)誤差，并將新算法包含在GATK基因組分析工具包內(nèi)。

“PacBio單分子測(cè)序技術(shù)能對(duì)基因組中的低頻變異進(jìn)行高效解讀，且能夠有效彌補(bǔ)Sequenom和Sanger方法的缺陷，可以尋找除已知位點(diǎn)以外的其他漏檢稀有突變。”

我們利用PacBio平臺(tái)對(duì)92株成神經(jīng)管細(xì)胞瘤（Medulloblastoma）原代細(xì)胞株的全外顯子組的Illumina測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了體細(xì)胞變異位點(diǎn)的驗(yàn)證分析。不僅驗(yàn)證了所有發(fā)現(xiàn)的SNP，連（在CTDNEP1基因中）短到2 bp的微缺失（Indel）變異也得到了很好的區(qū)分和識(shí)別。我們最終確認(rèn)了12個(gè)與成神經(jīng)管細(xì)胞瘤發(fā)生相關(guān)的變異，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)以前從未發(fā)現(xiàn)的突變，為這種疾病的基礎(chǔ)研究和臨床診斷提供了新的分子標(biāo)記物。

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)5、參考影像7/10、生物通往期文章1/2/3/8/10。

Swati Ranade：
 
自ENCODE（DNA元素百科全書）信息公布以來，被認(rèn)為是繼HGP之后的又一重大進(jìn)展，相當(dāng)于是給人類基因組繪制了一幅3D的Google Map。ENCODE里面提到，基因組中的垃圾DNA非但不是垃圾，而是龐大的控制面板，且存在超長距離的關(guān)聯(lián)。比如通常所說的編碼蛋白質(zhì)的外顯子區(qū)域只占2%左右，但其實(shí)基因組中80%的DNA區(qū)域都是活躍的，即非編碼區(qū)域的功能之前被極大忽視。另外GWAS識(shí)別出的SNP變異僅12%位于蛋白編碼區(qū)，但疾病關(guān)聯(lián)的SNP有60%以上定位于非編碼區(qū)，這些區(qū)域經(jīng)ENCODE識(shí)別具備功能，至少有400個(gè)熱點(diǎn)值得第一時(shí)間深入研究。所以說，ENCODE從基因組入手，GWAS從疾病入手，兩者結(jié)合，加上個(gè)體基因組信息，理論上可以預(yù)判疾病發(fā)生發(fā)展。

“這么一來，以往的研究就顯得視野狹窄了。比如以往只關(guān)注蛋白編碼區(qū)的SNP變異，或者僅在編碼區(qū)中進(jìn)行SNP串聯(lián)的所謂‘單倍體型（Haplotype）’,那只能算是狹義的分型。業(yè)界漸漸意識(shí)到，‘廣義單倍體型’才是未來個(gè)體醫(yī)療真正需要的有效信息，即應(yīng)該在基因編碼區(qū)和上下游非編碼區(qū)同時(shí)提取SNP關(guān)聯(lián)，并盡可能在更寬泛的DNA區(qū)域建立空間SNP（或Indel）串聯(lián)信息，因?yàn)榭赡苓�將涉及基因轉(zhuǎn)座、重組、同源簇等問題。”如果說以往的研究無法關(guān)注廣義單倍體型是束手于技術(shù)，那么如今第三代單分子測(cè)序的出現(xiàn)將能在很大程度上為分型領(lǐng)域的研究作出突破。PacBio的長讀長特點(diǎn)可以幫助建立更直接更精確的大范圍SNP串聯(lián)，可以在單次測(cè)序過程中貫通編碼區(qū)和非編碼區(qū)。為了解決靶向捕獲問題，PacBio與Agilent合作，針對(duì)0.5 M染色體（Chr10+X）和3 M Kinome這些同時(shí)包含編碼區(qū)和非編碼區(qū)的人類DNA區(qū)域，分別嘗試了Agilent SureSelect的標(biāo)準(zhǔn)捕獲（200-250 bp）和為配合PacBio長讀長特點(diǎn)的2 Kb捕獲并進(jìn)行測(cè)序比較，最終發(fā)現(xiàn)，“PacBio與Agilent SureSelect配合的最大好處是顯著提高了對(duì)以往難以靶向測(cè)序區(qū)域的覆蓋度，不僅可以在編碼區(qū)額外發(fā)現(xiàn)一些SNP變異，而且同時(shí)兼顧了編碼區(qū)和非編碼區(qū)的SNP關(guān)聯(lián)”。

此次與費(fèi)城兒童醫(yī)院和賓夕法尼亞大學(xué)的合作，主要是在HLA分型中應(yīng)用PacBio的長讀長測(cè)序特點(diǎn)。通過靶向測(cè)序進(jìn)行HLA分型的意義不言而喻，但目前的確存在一些瓶頸制約，比如因HLA基因群高度密集而導(dǎo)致常規(guī)靶向捕獲效率低下、因短讀長測(cè)序定位困難而導(dǎo)致僅能實(shí)現(xiàn)在HLA有限的幾個(gè)外顯子中進(jìn)行SNP/Indel Genotyping。“如果說PacBio與Agilent的合作主要側(cè)重于靶向捕獲技術(shù)的突破，那么與費(fèi)城兒童醫(yī)院的合作則主要側(cè)重于如何在HLA基因簇中進(jìn)行盡可能全方位的Phasing而不僅僅是Genotyping（即廣義單倍體分型）。”在初期方案中，我們先嘗試用長程PCR分別對(duì)HLA的A、B、C基因座進(jìn)行擴(kuò)增，涵蓋了所有8個(gè)外顯子和內(nèi)涵子及上下游非編碼區(qū)，可以滿足在某個(gè)基因座范圍內(nèi)進(jìn)行Phasing。“我們?cè)?0X覆蓋度下，可以在距離5 Kb的關(guān)聯(lián)范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)成對(duì)出現(xiàn)的SNP和Indel親本雜合型變異，這樣的例子有8個(gè)。”PacBio甚至還可以在包含高度重復(fù)序列的HLA-DRB基因中實(shí)現(xiàn)高度覆蓋。“隨著PacBio測(cè)序通量的進(jìn)一步提升和測(cè)序成本的逐步下降，科研人員不光可以對(duì)MHC Class I和II的基因進(jìn)行分型，還將有能力對(duì)所有MHC基因座進(jìn)行大范圍分型。”

可以說，PacBio的長讀長特點(diǎn)在靶向測(cè)序領(lǐng)域引入了一些新穎的應(yīng)用，除了廣義單倍體型外，還可以應(yīng)對(duì)復(fù)雜重復(fù)、可變剪切、轉(zhuǎn)座重排等，我們還在開發(fā)基于TdT末端延伸的方法，可以無需PCR、無需建庫（指兩端加莖環(huán)接頭的方式），有望在靶向測(cè)序的同時(shí)關(guān)注堿基修飾信息。

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)10、生物通往期文章1/2/3。

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• 串聯(lián)重復(fù)突變和低頻突變檢測(cè)

Neil Shah：
 
FLT3過去一直被認(rèn)為是急性髓細(xì)胞白血病（AML）的有效治療靶標(biāo)，可患者接受靶向FLT3新藥治療后一段時(shí)間會(huì)復(fù)發(fā)，即很容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致科研人員對(duì)FLT3是否是真正有效靶標(biāo)的論斷產(chǎn)生了諸多質(zhì)疑。

“但我們并沒有輕易放棄FLT3。”我們對(duì)8位白血病患者進(jìn)行了分析，這些患者都是在二期臨床實(shí)驗(yàn)中接受Ambit Biosciences研發(fā)的FLT3抑制劑AC220（Quizartinib）治療后復(fù)發(fā)的例子，表明患者出現(xiàn)了耐藥性。“我們決定用測(cè)序的方法對(duì)這些患者進(jìn)行深度解析，看看FTL3耐藥性是否跟突變有關(guān)，并如何利用突變信息為未來的臨床診斷和新藥研發(fā)提供信息。”

FLT3存在很多內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（ITD）突變，距離激酶結(jié)構(gòu)域大約800 bp。“我們猜測(cè)是否這些突變隱患是一早就存在的，一旦激活就會(huì)成為抗藥性突變，這樣我們就需要對(duì)大片段區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，讀長至少需要能應(yīng)付1000 bp左右的長度，才能保證真實(shí)解析突變的重復(fù)性和相互之間的位置關(guān)聯(lián)，這樣我們自然而然就想到利用PacBio的長讀長優(yōu)勢(shì)。”

實(shí)際應(yīng)用中，我們用CCS環(huán)形一致序列讀取模式獲得了平均讀長1.4 Kb的Reads。“我們對(duì)PacBio系統(tǒng)的測(cè)序結(jié)果非常滿意，它幫助我們?cè)诓』紡?fù)發(fā)階段發(fā)現(xiàn)了大量的突變組合，遠(yuǎn)比我們想象得復(fù)雜。”“（測(cè)序方法）在不遠(yuǎn)的將來會(huì)在臨床診斷方案決策過程中起到深遠(yuǎn)影響，可以為我們提供大量有效的下一代治療方案。”

在研究過程中我們還遭遇了第二輪挑戰(zhàn)，即怎樣檢測(cè)低頻突變并從常規(guī)的Base Call噪聲中凸顯出來。“我們知道標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法僅能檢測(cè)20%頻率的突變，這顯然不能滿足我們的需求。”所以我們一開始也不敢確定PacBio是否能應(yīng)付。“但實(shí)際使用下來，我們低估了PacBio，在單分子檢測(cè)條件下，我們竟然能檢測(cè)到最低至2.7%的突變。”

“這里需要明確的是，2.7%指的是在所有我們觀測(cè)的含有活性突變的等位基因中，有2.7%的比例是某一種形式的活性突變，并非是相對(duì)正常等位基因的低頻突變。”一方面我們的觀測(cè)樣本數(shù)足夠統(tǒng)計(jì)意義，另一方面相比其他方法我們確實(shí)從PacBio的長讀長數(shù)據(jù)中獲得了更多的信息。“盡管不好估計(jì)到底PacBio檢測(cè)敏感度是多高，但我們保守估計(jì)達(dá)到了1-3%的低頻突變范疇。”

“這個(gè)研究成果令我們大開眼界，沒想到FLT3的耐藥突變譜圖如此豐富。”我們比較關(guān)注的是，何種耐藥條件下突變出現(xiàn)在DNA單鏈上，抑或何種耐藥條件下突變?cè)陔p鏈上都有分布，以及何種突變組合對(duì)應(yīng)何種復(fù)發(fā)之后的其他并發(fā)癥。“如果能準(zhǔn)確了解基因突變出現(xiàn)在何時(shí)、何地、何種組合，以及耐藥性的并發(fā)性類型，那么對(duì)于新治療方法和藥物的開發(fā)無疑具有重要意義。換言之，我們認(rèn)為FLT3仍然是當(dāng)仁不讓的白血病潛在靶標(biāo)，未來在此基礎(chǔ)上的二次新藥開發(fā)還有很長的路要走。” “這些突變對(duì)于白血病細(xì)胞的生存極為重要。我們認(rèn)為，如果有能力在這些新發(fā)現(xiàn)的FLT3耐藥突變上重新進(jìn)行抑制，我們將有望再次開發(fā)出治療方案，這已成為未來靶向藥物研發(fā)的趨勢(shì)，并重燃用于急性髓細(xì)胞白血病治療的FLT3抑制劑的希望。”

用PacBio應(yīng)對(duì)低頻突變的例子不止一個(gè)。我們?cè)?011年12月參加美國血液學(xué)學(xué)會(huì)第53屆年會(huì)時(shí)就公布過類似的例子，利用PacBio技術(shù)檢測(cè)治療后復(fù)發(fā)的慢性髓性白血病（CML）病人中BCR-ABL激酶結(jié)構(gòu)域的稀有突變。“PacBio技術(shù)可以從大于850 bp的Amplicon中很好地區(qū)分突變類型到底是單倍體型還是二倍體型，對(duì)低頻突變的檢測(cè)靈敏度同樣高得驚人，我們有一個(gè)病人的樣本中檢測(cè)到的兩個(gè)單倍體型變異的突變頻率低至1%。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新穎的119 bp缺失變異。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)9、生物通往期文章1/2/3/9。

Andrew Kasarskis：

“通過對(duì)AML患者樣品中FLT3基因測(cè)序——這些患者接受靶向FLT3基因治療后復(fù)發(fā)，我們確定FLT3是一個(gè)有效的治療靶標(biāo)，并且這也將有助于科學(xué)家們更好的理解這種類型白血病的生理機(jī)制，從而研發(fā)出新型藥物。除此之外，我們進(jìn)行的上百個(gè)FLT3單分子測(cè)序，也有助于分析低頻罕見的耐藥性突變。這種技術(shù)上的提升能用于識(shí)別遲早會(huì)在病患臨床療程中出現(xiàn)的耐藥性問題，通過了解這些突變，我們能制定出更好的治療方案。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)9、生物通往期文章1/2/3/9。

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• 三聯(lián)核苷酸異常擴(kuò)增分析

Paul Hagerman：

脆性X綜合癥是一類在基因型上非常特殊的疾病，它伴隨著X染色體上FMR1基因的非翻譯區(qū)CGG序列異常擴(kuò)增。“如果你從宏觀的角度去審視這個(gè)基因，你會(huì)發(fā)現(xiàn)（CGG片段異常擴(kuò)增）與認(rèn)知力和生殖功能受損相關(guān)，是自閉癥的其中一個(gè)主要誘因，也跟早期卵巢衰竭和單基因神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。如果做個(gè)統(tǒng)計(jì)，我們說到的這些病僅在美國就對(duì)應(yīng)150萬確診患者。想象一下，如果有一套行之有效的篩查手段，那么事實(shí)上對(duì)應(yīng)的患者將超過1000萬。”

CGG片段異常擴(kuò)增與發(fā)病程度的關(guān)聯(lián)主要體現(xiàn)在重復(fù)程度上，重復(fù)超過55次（Pre-mutation，前突變）就會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育障礙的臨床表型，超過200次（Full-mutation，全突變）就會(huì)導(dǎo)致FMR1基因沉默，出現(xiàn)脆性X綜合癥，重復(fù)越多，癥狀越明顯。另外，異常擴(kuò)增過程中還涉及突變。“我們最近發(fā)現(xiàn)，CGG重復(fù)區(qū)中出現(xiàn)的AGG突變程度有助于判斷新生兒患脆性X綜合癥的傾向。”比方說，一個(gè)攜帶前突變的母親在CGG重復(fù)區(qū)中擁有兩個(gè)AGG突變，那她生下一個(gè)攜帶全突變等位基因的嬰兒的幾率在15-20%，但如果她不含有AGG突變，那生下攜帶全突變嬰兒的幾率立即上升到80%左右。“我們剛才僅提到了相距30個(gè)核苷酸范圍內(nèi)含兩個(gè)AGG突變的情況，如果把視野在基因組范圍內(nèi)放大，那么差異將是天翻地覆。”大范圍序列的CGG重復(fù)和突變解讀無疑至關(guān)重要，“而且用測(cè)序法解讀CGG的重復(fù)次數(shù)是最簡便的臨床診斷方式”。

對(duì)脆性X綜合癥患者的CGG重復(fù)區(qū)進(jìn)行測(cè)序存在諸多技術(shù)挑戰(zhàn)，精確解析重復(fù)次數(shù)以及發(fā)現(xiàn)內(nèi)部突變都不容易實(shí)現(xiàn)。“二代短讀長測(cè)序技術(shù)無法勝任這項(xiàng)工作，如果僅能讀取幾百個(gè)核苷酸的長度，那你很容易就陷在CGG重復(fù)區(qū)內(nèi)部了。”請(qǐng)注意，這是個(gè)100% GC含量的區(qū)域，二代測(cè)序法根本無法跨越。而Sanger法也無法檢測(cè)超過100個(gè)以上的CGG重復(fù)，且生成的都是不連貫的信號(hào)，相當(dāng)于我們無法獲得單堿基分辨率的測(cè)序數(shù)據(jù)。何況Sanger法的低效無法切實(shí)滿足臨床高效診斷的需求。也有科學(xué)家依賴于Southern Blot和PCR技術(shù)，以獲得大致的重復(fù)長度和AGG突變程度，但當(dāng)重復(fù)區(qū)太長時(shí)，精確性太差且無法定位AGG。PacBio RS系統(tǒng)的出現(xiàn)確實(shí)是基因型異常疾病臨床診斷的福音，從原理上講，單分子測(cè)序幾乎不受高GC的任何限制，哪怕是100% GC含量，何況長讀長的特點(diǎn)完全可以應(yīng)付高達(dá)1000次左右的CGG超重復(fù)，還有它的高速。“我是在UC Davis的基因組研究中心聽說了PacBio系統(tǒng)，隨后拜讀了一些PacBio發(fā)表的文章，我立即意識(shí)到，這就是我們想要的,并迫不及待地想嘗試一下”。

我們選擇用PacBio的CCS環(huán)形比對(duì)測(cè)序模式提高精確性，從大量擴(kuò)增的CGG重復(fù)序列中產(chǎn)生高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。“我們證實(shí)了PacBio可以測(cè)超過750個(gè)CGG重復(fù)片段，并能夠精確定位AGG突變。”“這種方法保障了單堿基分辨率，今后也能完整鑒定所有與疾病相關(guān)的等位基因，從而有利于準(zhǔn)確及時(shí)的臨床診斷。”

一些攜帶脆性X突變的患者同時(shí)具備前突變和全突變兩種形式，即一條染色體上是前突變重復(fù)，另一天染色體上是全突變重復(fù)，額外還有AGG突變分布，是一種嵌合型突變（Mosaic Mutation），而且情況有些像癌癥中的體細(xì)胞突變異質(zhì)性，不同細(xì)胞的嵌合型突變類型還不盡相同。含嵌合型突變的患者顯然要比僅含全突變的患者給出的臨床反饋要復(fù)雜得多。“那些含較少重復(fù)片段的等位基因或次要等位基因（Minor Alleles）在很多情況下可以起到臨床診斷的決定因素。”比如，全突變型等位基因不能產(chǎn)生FMR1蛋白，但另一個(gè)前突變類型的等位基因可以產(chǎn)生少量蛋白，那么最終病癥顯然要輕微得多，但一考慮細(xì)胞突變的異質(zhì)性，治療方案的制定就顯得異常復(fù)雜。“所以如果我們能夠真真切切地指出那些嵌合型等位基因各自包含的具體信息，就會(huì)顯著改善我們對(duì)臨床診斷結(jié)果的認(rèn)識(shí)。” “可以想象一下，如果患者僅有一條染色體是全突變模式，而一串相關(guān)的等位突變散亂地鑲嵌在全突變和前突變兩條染色體上，各貢獻(xiàn)1%的發(fā)病率，那么患者多大程度受到疾病影響完全就由這些等位突變的定位分布形式?jīng)Q定，用常規(guī)測(cè)序或Southern Blot的方法是無法看到這些精確信息的。之所以說PacBio如此強(qiáng)大，就因?yàn)镻acBio可以一次看清楚所有的等位突變和定位，無論是稀有的還是常規(guī)的。它是單個(gè)單個(gè)分子測(cè)過去，之后的突變分析就變得跟數(shù)數(shù)那么簡單。”

PacBio的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)可以對(duì)大片段重復(fù)序列區(qū)域進(jìn)行直接測(cè)序，從而可以清楚地分辨出雜合型等位基因。“當(dāng)我第一次聽說這個(gè)技術(shù)的時(shí)候，我立即認(rèn)識(shí)到這正是我們想要的機(jī)會(huì)。有了這個(gè)技術(shù)，你可以真正獲得每一個(gè)不同片段長度的DNA序列信息，并能分辨出99%以上的稀有等位基因信息。”“FMR1基因有太多的跟臨床診斷相關(guān)的功能特性，我們目前還未一一得知，有了PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)，我們可以對(duì)所有這些等位基因進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)還可以對(duì)甲基化狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。”在測(cè)序的過程中發(fā)現(xiàn)，DNA聚合酶的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)重復(fù)區(qū)的周邊序列已很敏感。“這些發(fā)現(xiàn)為檢測(cè)CGG重復(fù)區(qū)域的表觀遺傳修飾奠定了基礎(chǔ)。”

“我們的發(fā)現(xiàn)將成為非常重要的科研工具，同時(shí)還將是非常重要的診斷工具，有望填補(bǔ)臨床篩查的空白或薄弱環(huán)節(jié)，對(duì)攜帶三聯(lián)核苷酸重復(fù)的人群進(jìn)行普遍篩查，比如在現(xiàn)有例子中，可以對(duì)與神經(jīng)發(fā)育、生殖缺陷、神經(jīng)退行性疾病發(fā)生休息相關(guān)的FMR1基因的CGG重復(fù)區(qū)進(jìn)行測(cè)序篩查。”我們正在把研究成果轉(zhuǎn)化到臨床診斷的應(yīng)用中去，把CGG重復(fù)區(qū)片段大小、次要等位基因信息、甲基化修飾等等跟臨床病患嚴(yán)重性或治療干預(yù)結(jié)果對(duì)應(yīng)起來。比如我們最新的研究發(fā)現(xiàn)，某種藥物的最終療效就跟病患是全突變型抑或是嵌合型突變相掛鉤。“隨著對(duì)雜合型突變認(rèn)識(shí)的深化，這完全有望成為藥物療效的預(yù)測(cè)手段。”考慮到通量問題，我們還會(huì)適時(shí)引入Barcode進(jìn)行混合樣本篩查，“最終的通量可以允許在可接受的價(jià)格范圍內(nèi)進(jìn)行基于基因分型的人群普篩”。

除此之外，我們還希望把PacBio應(yīng)用到脆性X染色體癥的新生兒高通量篩查中去。“這個(gè)平臺(tái)具備快速篩查的潛能，然而其他現(xiàn)行方法無能為力。”之所以需要快速篩查是因?yàn)榕R床上已經(jīng)具備早期干預(yù)的辦法，可以讓新生兒在確癥后立即接受早期治療。“我們希望在一到兩年內(nèi)開發(fā)并驗(yàn)證這套臨床診斷或快速篩查方法。我們的目標(biāo)是把它應(yīng)用到CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments，美國臨床實(shí)驗(yàn)提高修正案）實(shí)驗(yàn)室中去，而且義無反顧地去實(shí)施。盡管儀器比較貴，但如果能接受上千例的臨床診斷或快速篩查，這個(gè)費(fèi)用就會(huì)被很好地稀釋掉。”

PacBio單分子測(cè)序技術(shù)還可以應(yīng)用于其他序列重復(fù)關(guān)聯(lián)疾病的臨床診斷，比如強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥（Myotonic Dystrophy）、亨廷頓氏舞蹈癥（Huntington's Disease）、弗里德里希共濟(jì)失調(diào)癥（Friedreich's Ataxia）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis）、額顳葉癡呆癥（Frontal Temporal Dementia）等。“從實(shí)用角度而言，長讀長測(cè)序技術(shù)確實(shí)可以做到（針對(duì)序列重復(fù)關(guān)聯(lián)疾病）開發(fā)更優(yōu)越的診斷流程。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)7、參考影像1/6/11、生物通往期文章1/2/3/4/7。

Lisa Edelmann：

“盡管這篇文章只相當(dāng)于一個(gè)PoP實(shí)驗(yàn)，但它著實(shí)拓寬了人們的視野，開始關(guān)注臨床診斷的一些問題，比如，對(duì)大片段重復(fù)序列進(jìn)行直接測(cè)序是否有助于判斷預(yù)后或療效。”

Vincent Magrini：

三聯(lián)體核苷酸異常擴(kuò)增與很多遺傳疾病發(fā)生相關(guān)聯(lián)，丘腦底核萎縮癥（Subthalamic Nucleus Atrophy）就是如此。該病癥調(diào)控關(guān)鍵基因ATN1第5號(hào)外顯子上含有CAG三聯(lián)體核苷酸重復(fù)，正常情況下從6個(gè)到35個(gè)重復(fù)不等，一旦超過48個(gè)以上就會(huì)引發(fā)丘腦底核萎縮。

“靶向測(cè)序法檢測(cè)CAG重復(fù)將是臨床快速診斷行之有效的方法。”CAG區(qū)域極易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二代測(cè)序過程中PCR無法正常跨越，且GC含量也相對(duì)較高。“但這些困難在單分子測(cè)序方法中就不算什么”。

為了響應(yīng)快速診斷，臨床上有可能對(duì)混合樣本進(jìn)行測(cè)序，所以我們有必要設(shè)計(jì)Barcode，以便區(qū)分混合樣本。二代測(cè)序法同樣也不適合混合樣本檢測(cè)，依賴PCR的測(cè)序方式會(huì)導(dǎo)致混合樣本中不同豐度的模板分子出現(xiàn)極大的擴(kuò)增效率差異，從而導(dǎo)致最終結(jié)果失真。我們針對(duì)PacBio容易出現(xiàn)因插入而引起的隨機(jī)誤差的特點(diǎn)，用模擬算法篩選出了14對(duì)6位Barcode序列，這些Barcode序列在測(cè)序過程中有很高的插入誤讀容忍度，所以可以在第一時(shí)間相互區(qū)分出來，然后通過PCR法把Barcode連到待測(cè)樣本的擴(kuò)增子上就可以了。

考慮到實(shí)驗(yàn)漸進(jìn)性，我們先做了個(gè)模擬實(shí)驗(yàn)。我們把14對(duì)Barcode加到已知CAG拷貝數(shù)的ATN1第5號(hào)外顯子的擴(kuò)增產(chǎn)物上，這些擴(kuò)增子間只有濃度不同，不同濃度對(duì)應(yīng)不同的Barcode，相當(dāng)于人為在單一樣本中引入復(fù)雜性。最后我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)方法還是行之有效的，我們用Barcode區(qū)分出了不同濃度，最終的PacBio測(cè)序結(jié)果也能真實(shí)還原CAG拷貝數(shù)。這一部分的工作我們還在繼續(xù)，期望這套方法能最終應(yīng)用到臨床快速診斷上。

注: 詳情請(qǐng)見參考影像6、生物通往期文章1/2/3。

David Mittelman：

我們致力于在多種遺傳病中研究三聯(lián)核苷酸重復(fù)印記，這些疾病包括亨廷頓氏舞蹈癥（Huntington's Disease）、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)癥（Spinocerebellar Ataxias）等。在這些疾病中，三聯(lián)核苷酸重復(fù)可以連成幾百個(gè)堿基，不僅如此，重復(fù)程度還存在體細(xì)胞間差異（Somatic Variation），我們稱之為基因組重復(fù)區(qū)不穩(wěn)定性（Genomic Repeat Instability）。用測(cè)序獲得重復(fù)區(qū)信息是最直接的方法，但目前用一代和二代測(cè)序技術(shù)都不是很奏效，“而PacBio第三代單分子測(cè)序技術(shù)卻可以在全長重復(fù)區(qū)段實(shí)現(xiàn)完整覆蓋，并確保不引入PCR偏好性”。

為了有效區(qū)分不同體細(xì)胞之間的差異性，我們?cè)跍y(cè)序起始階段引入Barcode。“PacBio在這方面的應(yīng)用潛力巨大，它可以單分子的形式完整捕獲這些長片段重復(fù)區(qū)域，從而方便我們細(xì)致觀察不同細(xì)胞間的差異。”確切地說，我們?cè)陂_發(fā)一種針對(duì)三聯(lián)核苷酸重復(fù)相關(guān)疾病的新型療法。我們?cè)?009年的PNAS上就發(fā)表了該項(xiàng)PoC（Proof of Concept）研究成果，用基因工程改良過的鋅指核酸酶來永久性地定向切除并縮短CAG三聯(lián)子重復(fù)序列。“如果你能把重復(fù)程度縮到足夠小，你就有可能推遲疾病癥狀的出現(xiàn)。”用PacBio測(cè)序法不僅可以衡量鋅指核酸酶對(duì)三聯(lián)子重復(fù)區(qū)的切除效果，還可以研究重復(fù)區(qū)不穩(wěn)定性。“PacBio有很多途徑可以令其在某個(gè)測(cè)序領(lǐng)域脫穎而出引領(lǐng)潮流，這個(gè)領(lǐng)域目前可以不熱門，比如我們說測(cè)三聯(lián)核苷酸重復(fù)。在個(gè)體診療趨勢(shì)下，不遠(yuǎn)的將來人們將會(huì)在個(gè)體中研究遺傳印記多樣性，這就是PacBio的機(jī)會(huì)所在。”我們目前的方法還需要PCR擴(kuò)增，但未來將可以實(shí)現(xiàn)直接捕獲三聯(lián)子重復(fù)序列，或者至少可以做到僅需少量擴(kuò)增。“總有一天，技術(shù)會(huì)強(qiáng)大到在病人身上獲取組織樣品并直接捕捉所需的DNA序列，然后用PacBio進(jìn)行單分子測(cè)序，這將有助于降低分析噪聲。”

注: 詳情請(qǐng)見參考影像6、生物通往期文章1/2/3。

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• mRNA可變剪切和病毒變異分型

Frederic Bushman：

HIV-1病毒一直是我們實(shí)驗(yàn)室研究的主攻方向。“HIV-1只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，卻有多種剪切異構(gòu)體，我們認(rèn)為是研究可變剪切的非常好的模型。通過研究可變剪切我們可以了解病毒的復(fù)制過程。”

測(cè)序無疑是研究可變剪切最直接的方式，而且現(xiàn)在測(cè)序項(xiàng)目炙手可熱，但在選擇何種測(cè)序平臺(tái)上，我們?cè)谝婚_始就想了很多。“第二代測(cè)序平臺(tái)生成的片段過短，必須進(jìn)行片段拼接，而拼接就會(huì)失去轉(zhuǎn)錄組可變剪切的真實(shí)信息，回過頭來還是需要通過猜測(cè)和推斷來分析剪切位點(diǎn)。而單分子測(cè)序則不同，其生成的長片段能一次性完成通讀，有助于在大范圍內(nèi)對(duì)可變剪切位點(diǎn)進(jìn)行直接分析。”此外PacBio的CCS測(cè)序模式能夠提供準(zhǔn)確度非常高的序列數(shù)據(jù)，使得轉(zhuǎn)錄組可變剪切位點(diǎn)分析更加準(zhǔn)確。

我們先將HIV-1的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后用PacBio RS系統(tǒng)進(jìn)行cDNA測(cè)序。通過分析，我們發(fā)現(xiàn)了109個(gè)HIV-1獨(dú)有的可變剪切產(chǎn)物，其中兩個(gè)還編碼新的蛋白。我們研究的價(jià)值更體現(xiàn)在，我們發(fā)現(xiàn)了HIV-1的剪切模式具有很大的異質(zhì)性，即不同階段和微環(huán)境下剪切模式會(huì)隨之發(fā)生改變。這是一個(gè)很重要的發(fā)現(xiàn)，從一定程度上揭示了HIV病毒的高度變異性，有望為HIV病毒的反侵染和艾滋病治療研究提供寶貴線索。

HIV-1病毒是一種典型的RNA病毒，其基因組比目前已知的任何一種病毒基因組都復(fù)雜。“PacBio的單分子測(cè)序技術(shù)從原理上還有突破空間，比如有望直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序，對(duì)于這一點(diǎn)我們翹首企盼。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)3、生物通往期文章1/2/3/6。

Michael Brown：

HIV-1病毒的基因組比已知任何其他病毒基因組都要復(fù)雜，由于部分HIV病毒會(huì)在感染初期逃脫體內(nèi)的免疫反應(yīng)，并通過快速的基因組重組而不被免疫系統(tǒng)識(shí)別，在受感染者體內(nèi)存活下來并進(jìn)一步繁殖。這樣在一個(gè)感染者體內(nèi)HIV-1病毒就形成了一個(gè)以優(yōu)勢(shì)株為主的相關(guān)突變株病毒群，即稱為準(zhǔn)種（Quasispecies），以利于其在不良環(huán)境下生存。因此，目前研究認(rèn)為準(zhǔn)種分析與病毒的抗藥性有著密切的關(guān)系，例如臨床醫(yī)生如果可以方便的獲得患者血清中的病毒準(zhǔn)種特點(diǎn)，又能清楚的了解不同準(zhǔn)種對(duì)不同藥物敏感性的差別，就便于優(yōu)化抗病毒治療藥物的選擇和方案的制定，從而提高病毒感染者抗病毒治療的效果。

“盡管二代測(cè)序可以提供高通量的測(cè)序數(shù)據(jù)，但是由于讀長短，因而不能覆蓋整個(gè)病毒分子基因組，所以也就不能確定多個(gè)突變位點(diǎn)是來源于一個(gè)分子還是不同分子。而PacBio長讀長測(cè)序可以直接輕松跨越整個(gè)HIV-1病毒基因組（9kb），因此非常適合發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異。”

埃默里大學(xué)（Emory University）AIDS研究中心與贊比亞的研究組進(jìn)行合作，研究HIV-1病毒在傳染的過程中準(zhǔn)種的變化。以往他們采用的是單基因組擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)（SGA），即從病人的血漿中分離病毒并獲得其cDNA，然后進(jìn)行有限稀釋直至每個(gè)孔里只有一個(gè)病毒基因組，再次擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行準(zhǔn)種分析。利用該方法，在8-10天內(nèi)只能完成30個(gè)病毒基因組的分析。隨后他們與我們進(jìn)行了合作，希望用PacBio嘗試以期提高效率和分辨率。“利用PacBio單分子測(cè)序，由于每個(gè)ZMW即可以對(duì)單個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，因此在不到90分鐘的時(shí)間即可完成1000-3000個(gè)病毒基因組的分析工作。”

準(zhǔn)種分析表明，供體（Donor）體內(nèi)的HIV-1可以分為6個(gè)Cluster，而在被傳染的受體內(nèi)，只檢測(cè)到其中的一種Cluster。通過與之前的Sanger法的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)PacBio的數(shù)據(jù)中，12個(gè)樣本是和之前的Sanger法完全吻合的，而在9個(gè)樣本中，每個(gè)樣本會(huì)有1-3個(gè)堿基的差異。通過對(duì)Sanger數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些差異源于Sanger測(cè)序在進(jìn)行Base Call的時(shí)候有的堿基被識(shí)別成了R。經(jīng)過比對(duì)矯正，PacBio矯正了原有Sanger數(shù)據(jù)中的3948個(gè)錯(cuò)誤的A位點(diǎn)。

注: 詳情請(qǐng)見參考影像9、生物通往期文章1/2/3。

Ellen Paxinos：

病毒耐藥性突變分型在慢性病毒感染等臨床診斷領(lǐng)域具有十分重要的意義。目前一般采用CE測(cè)序法，但受限于通量往往只關(guān)注重要的突變；二代測(cè)序由于采用PCR而存在可靠性方面的擔(dān)憂，同時(shí)不能實(shí)現(xiàn)線性定量并勝任低限檢測(cè)。因此我們?cè)赑acBio平臺(tái)上嘗試了HBV病毒的耐藥性突變檢測(cè)，希望能回答兩個(gè)主要問題，即檢測(cè)低限在哪和能否線性定量。我們擴(kuò)增了兩個(gè)HBV基因組中的一段575 bp和1389 bp，每組片段中其中一個(gè)為WT，另一個(gè)為Mutant，含有三個(gè)位點(diǎn)的堿基突變。然后將WT和Mutant以不同比例混合，然后用PacBio檢測(cè)不同混合物中突變的頻率。“單分子測(cè)序的可以檢測(cè)到低至0.078%的突變頻率，并且在不同的混合條件下保持了非常好的線性，并且由于PacBio的長度長可以準(zhǔn)確的對(duì)病毒突變位點(diǎn)進(jìn)行分型，這對(duì)于HIV-耐藥性研究具有重要意義。”

注: 詳情請(qǐng)見參考影像8、生物通往期文章1/2/3。

Jonas Korlach：

百日咳鮑特菌（B. Pertussis）是一種病原體，基因組大小為4 M，其中10%的區(qū)域?yàn)橹貜?fù)元素。盡管市面上有相應(yīng)的疫苗，但有效性僅有80%，且逃逸疫苗治療的菌株數(shù)量還在進(jìn)一步上升。該病原體基因組測(cè)序記錄之前僅有兩例，其中一例采用Sanger法測(cè)序，用了130000個(gè) Reads，另一例采用454和Sanger混合測(cè)序的方法，拼出了300多個(gè)Contig，額外還需要10000個(gè)Sanger數(shù)據(jù)進(jìn)行填補(bǔ)，可見病原體基因組測(cè)序在當(dāng)今仍是難點(diǎn)。

在與荷蘭公共健康和環(huán)境研究所的合作項(xiàng)目中，我們對(duì)9個(gè)百日咳鮑特菌菌株進(jìn)行了測(cè)序，其中包括一些疫苗逃逸菌株。基本上，4-8個(gè)SMRT Cell就可以測(cè)完一個(gè)菌株，并拼成一個(gè)完整的Contig。“現(xiàn)在我們已經(jīng)獲得了大量導(dǎo)致菌株間差異的結(jié)構(gòu)變異信息。”通過繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以幫助我們了解菌株間的親緣關(guān)系和進(jìn)化次序。在進(jìn)化樹中，早期用Sanger法測(cè)序的菌株離其他菌株的關(guān)系較遠(yuǎn)，其中發(fā)現(xiàn)有4個(gè)轉(zhuǎn)座相關(guān)的移動(dòng)元素（Mobile Element），而用PacBio測(cè)序的9個(gè)菌株中還發(fā)現(xiàn)了其他5個(gè)移動(dòng)元素。

我們還測(cè)了幾株沙門氏菌（Salmonella），僅用了不到一個(gè)星期，其中包括一株10月份在亞利桑那爆發(fā)的菌株，在這個(gè)菌株中含有兩個(gè)全新序列的質(zhì)粒，這些新穎序列現(xiàn)在已經(jīng)可以用作臨床診斷的依據(jù)。除此之外，我們同時(shí)還觀察了表觀修飾信息，并發(fā)現(xiàn)了一種新穎的堿基修飾——硫代膦酸修飾（Phosphorothiation），即DNA骨架中非橋聯(lián)的氧原子為硫原子所替代，該修飾可能跟氧應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

在與CDC和FDA的合作中，PacBio公司還測(cè)了16株利斯特桿菌（Listeria）并發(fā)現(xiàn)了一些特有的甲基化譜，其中包含一個(gè)在胸腺嘧啶上的修飾。

注: 詳情請(qǐng)見參考影像3/5，生物通往期文章1/2/3/4/5。

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• 臨床快速診斷實(shí)施和無需建庫方案

Andrew Brown：

新一代測(cè)序技術(shù)正在為癌癥研究帶來一輪前所未有的變革，全基因組范圍的信息可以提供一系列分子事件上的表征，這些表征對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展和手術(shù)預(yù)后等的評(píng)估意義重大。

OICR已經(jīng)有兩臺(tái)PacBio RS系統(tǒng)，并正式投入到臨床診斷基因組學(xué)的應(yīng)用中。我們需要測(cè)試這個(gè)系統(tǒng)把它發(fā)揮到最佳狀態(tài)，通過全基因組測(cè)序的方法解讀癌癥基因及其他癌癥治療敏感性或抑制性相關(guān)的遺傳標(biāo)記。“到目前為止，共有30多個(gè)病人參與了我們的測(cè)試，在鑒定出的影響藥物療效的基因列表中，有2個(gè)以前從未報(bào)道過的可變剪切。隨后我們還將擴(kuò)大關(guān)注基因的范圍，招募更多地病人參與其中。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)1/4/8、生物通往期文章1/2/3。

John McPherson：

OICR的目標(biāo)是試圖建立起一套對(duì)癌癥病人的測(cè)序體系，這樣可以幫助醫(yī)生獲取更多信息，輔助做出更恰當(dāng)?shù)暮罄m(xù)治療方案或臨床試驗(yàn)安排，并希望最終能將這套體系應(yīng)用于對(duì)癌癥病人的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理流程中。“我們希望在3周內(nèi)就可以反饋結(jié)果，這個(gè)時(shí)間指從病人知情并同意到拿到報(bào)告，因此在測(cè)序環(huán)節(jié)的時(shí)間需要控制在1-2天。”整個(gè)流程包括：病人簽署同意書，組織活檢、DNA抽提、測(cè)序、分析、驗(yàn)證以及同臨床醫(yī)生和研究人員開會(huì)給出相關(guān)報(bào)告。“由于周轉(zhuǎn)時(shí)間的限制，PacBio RS系統(tǒng)快速測(cè)序能力也是我們選擇它的一個(gè)主要原因。我們擁有PacBio快一年了，它確實(shí)用起來又快又方便。”同時(shí)，PacBio的序列無偏好性測(cè)序的特點(diǎn)也是一個(gè)重要考慮因素。“由于我們需要塑造一套臨床診斷系統(tǒng)，我們必須保證在所要檢測(cè)的任何一個(gè)基因上都能達(dá)到100%的覆蓋率。” “Mate-pair和Paired-ends這些方法需要太多手工作業(yè)，何況還需要投入大量的起始量，真的是相對(duì)低效。”

我們從PacBio上獲得的結(jié)果非常好，平均讀長在1800 bp左右。我們主要采用CCS環(huán)形比對(duì)測(cè)序模式來確保測(cè)序的準(zhǔn)確性，并且獲得擴(kuò)增子數(shù)百倍覆蓋深度的數(shù)據(jù)。

目前我們已經(jīng)完成了對(duì)15個(gè)病人的測(cè)序，其中一半的病人19個(gè)基因中至少有1個(gè)發(fā)生了突變。隨后我們與加拿大瑪格麗特公主醫(yī)院Lillian Siu的一期臨床組合作，主要是用Sequenom的OncoCarta Panel試劑盒對(duì)OICR的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。幸運(yùn)的是，PacBio沒有錯(cuò)過任何一個(gè)OncoCarta Panel試劑盒檢出的突變，還能額外檢出試劑盒未涵蓋的新突變。“這就是我們?yōu)槭裁匆�做測(cè)序，我們希望能發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的檢測(cè)試劑盒未涵蓋的信息。”

與此同時(shí)，OICR還希望他們的測(cè)序體系獲得CLIA認(rèn)證。“把它變成CLIA實(shí)驗(yàn)室的一部分需要做很多的努力。”其中一個(gè)選擇就是把PacBio搬到已經(jīng)成為CLIA標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室中去。“不得不靠CLIA實(shí)驗(yàn)室去運(yùn)行和驗(yàn)證儀器。PacBio不會(huì)在近期就能投放到CLIA實(shí)驗(yàn)室中，但我們正朝那個(gè)方向努力。”其他小型測(cè)序儀，比如Ion Torrent PGM，由于廉價(jià)有可能吸引到CLIA實(shí)驗(yàn)室的目光。“但它實(shí)在太新了，數(shù)據(jù)更新太快，CLIA實(shí)驗(yàn)室反而不見得能接受，它希望看到一個(gè)更為穩(wěn)定的平臺(tái)。” 我們的二期測(cè)試要和多倫多3家醫(yī)院合作，需要把研究工作落實(shí)到CLIA實(shí)驗(yàn)室中，將綜合考慮醫(yī)院的數(shù)量、實(shí)驗(yàn)室空間和價(jià)格等等因素進(jìn)行更大范圍測(cè)試和比較。

臨床診斷測(cè)序模式終將從靶向重測(cè)序逐漸向全轉(zhuǎn)錄組或全基因組方向轉(zhuǎn)移。加拿大公共衛(wèi)生系統(tǒng)傾向于把它做成面向所有癌癥患者的保健標(biāo)準(zhǔn)，而非簡單地收費(fèi)服務(wù)模式。“我希望能很快看到這一天。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)1/4/8、生物通往期文章1/2/3。

Janet Dancey：

PacBio在一期實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)確實(shí)非常鼓舞人。“我想每個(gè)參與的人都會(huì)由衷地感嘆我們自己的發(fā)現(xiàn)，包括那些患者和臨床醫(yī)生。”先期用PacBio系統(tǒng)啟動(dòng)了50個(gè)癌癥患者的測(cè)序工作，使用的平均覆蓋度為600X，所有檢測(cè)基因都100%覆蓋，沒有漏過任何一個(gè)堿基。這些結(jié)果增強(qiáng)了我們想把臨床診斷測(cè)序項(xiàng)目最終付諸實(shí)施的信心和決心。“我們目前對(duì)PacBio很滿意，相比較Sequenom Panel，PacBio不但沒有漏檢，而且還可以發(fā)現(xiàn)額外更多的信息。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)1/4/8、生物通往期文章1/2/3。

Eric Schadt：

我在西奈山醫(yī)院的授權(quán)是確保最大程度地利用病人提供的信息，即當(dāng)病人跨出大門時(shí)，我們的臨床研究人員需要從大量的電子記錄中最大程度地汲取有效信息，從而指導(dǎo)病人得到更好的后續(xù)醫(yī)療。

西奈山測(cè)序平臺(tái)擁有2臺(tái)HiSeq 2000、2臺(tái)HiSeq 2500、1臺(tái)MySeq、1臺(tái)PacBio RS、1臺(tái)Ion Proton，測(cè)序平臺(tái)與遺傳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室共享CLIA實(shí)驗(yàn)室執(zhí)照。這意味著可以形成一整套起始流程，從整合一系列組學(xué)方法，到建立疾病狀態(tài)預(yù)測(cè)模型，到匹配已有藥物所對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵致病基因，最終幫助發(fā)現(xiàn)并改善后續(xù)治療方案。在把海量信息整合的過程中，我們發(fā)現(xiàn)依靠PacBio的長讀長測(cè)序可以幫助我們更好地建立這樣空間關(guān)聯(lián)，這個(gè)方法無可替代，尤其是在基因組的高度重復(fù)區(qū)域和高GC含量區(qū)域。

因此我們計(jì)劃將PacBio測(cè)序平臺(tái)逐步應(yīng)用到開發(fā)系列臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)上，從自閉癥開始，接著是攜帶篩查、新生兒代謝疾病篩查、最終還將發(fā)布癌癥和其他相關(guān)疾病的基因篩查列表，目前該計(jì)劃正在尋求紐約州政府的批復(fù)。我們之前的工作基于國家已批準(zhǔn)的方法，即Sanger測(cè)序法，用全基因測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn)疾病關(guān)聯(lián)基因的典型突變。“在PacBio的幫助下，我們正在獲取國家認(rèn)可的變異信息之外的包含在基因序列上的其他任何附加突變信息。”

我們?cè)赑acBio上已經(jīng)獲得了1200萬Reads，測(cè)序深度達(dá)到10X以上，平均讀長為4066 bp，準(zhǔn)確性達(dá)到99%以上。我們正在關(guān)注20種基因，均含有大量重復(fù)區(qū)域，用短讀長測(cè)序的方法很難解決，因此必須輔以PacBio。比如在測(cè)CACNA1A基因（與某種神經(jīng)障礙相關(guān)）時(shí)，PacBio單次讀長就可以貫穿兩個(gè)相隔1 Kb的長重復(fù)區(qū)域。在測(cè)其他三聯(lián)核苷酸重復(fù)時(shí)，共10000個(gè)重復(fù)區(qū)，每個(gè)重復(fù)區(qū)含至少50個(gè)重復(fù)單元，PacBio僅用了10X基因組深度就可以覆蓋84%的重復(fù)區(qū)域。另外，在MHC測(cè)序項(xiàng)目中，PacBio找回了在Illumina測(cè)序過程中丟失的500 bp區(qū)域，并同時(shí)找回了在Illumina和454測(cè)序過程中同時(shí)丟失的雜合子信息。

西奈山CLIA實(shí)驗(yàn)室即將獲批Illumina/PacBio混合外顯子組測(cè)序許可證，可以針對(duì)5 Mb大小的靶向捕獲進(jìn)行測(cè)序，這些區(qū)域涵蓋大量通常難以測(cè)序的復(fù)雜基因結(jié)構(gòu)。

注: 詳情請(qǐng)見參考影像2/5、生物通往期文章1/2/3/4/5。

Peter Pohl：

GATC Biotech公司從德國聯(lián)邦教育與研究部BMBF的KMU企業(yè)創(chuàng)新資助項(xiàng)目中獲資50萬歐元，將通過和子公司LifeCodexx合作的模式，在PacBio平臺(tái)上開發(fā)先兆子癇（Preeclampsia，指妊娠24周左右，在高血壓、蛋白尿基礎(chǔ)上，出現(xiàn)頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀）臨床診斷方案。在德國，先兆子癇發(fā)病率在孕婦中占到2-5%，成為準(zhǔn)媽媽和未出生嬰兒的頭號(hào)殺手，這個(gè)現(xiàn)象不容忽視。我們公司將“立即投入到”PacBio單分子測(cè)序平臺(tái)的方法學(xué)研究中。利用單分子測(cè)序平臺(tái)，“臨床診斷的費(fèi)用和周期將會(huì)大幅度下降”。

此外，GATC Biotech公司還從德國聯(lián)邦經(jīng)濟(jì)技術(shù)部（Federal Ministry of Economics and Technology）獲資12萬歐元，將和蘇黎世瑞士聯(lián)邦工學(xué)院合作開發(fā)基于測(cè)序法的食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)監(jiān)控流程，追溯諸如奶酪生產(chǎn)過程中的腐壞問題，在這個(gè)項(xiàng)目中也將看到PacBio RS系統(tǒng)的身影。

注: 詳情請(qǐng)見生物通往期文章1/2/3。

Paul Coupland：

Sanger研究院首次研發(fā)出了一種在PacBio系統(tǒng)上無需文庫制備就能完成單分子測(cè)序的新技術(shù)，所需DNA樣品起始量可以低至1 ng。“這是首次實(shí)現(xiàn)了DNA單分子的直接測(cè)序。”固然，這個(gè)新技術(shù)可以簡化基因組測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)流程及減少DNA樣品的測(cè)序起始量，但最大的好處其實(shí)是不再擔(dān)心文庫制備過程中的偏差問題。建庫過程中DNA樣本往往被擴(kuò)增上千倍，樣本中基因量的線性關(guān)系就會(huì)出現(xiàn)偏差，用測(cè)序法進(jìn)行定量就會(huì)受到影響。所以說無需建庫過程將大大提高測(cè)序的精確性，“你測(cè)序的樣品就是你手上實(shí)實(shí)在在的樣品”。“在讀長和精度方面不會(huì)有負(fù)面影響，因?yàn)镻acBio已經(jīng)是單分子測(cè)序模式了，這個(gè)方法只不過是跳過了文庫制備過程，從而直接進(jìn)入測(cè)序環(huán)節(jié)。”

“我們利用這種新方法，完成了病毒和細(xì)菌的基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)即使是沒花大力氣進(jìn)行條件優(yōu)化，我們也能鑒定出是何種生物，并且就算這些生物體內(nèi)帶有一些特殊的基因或質(zhì)粒（決定抗生素耐藥性），或者譬如特殊DNA堿基修飾之類的遺傳信息，都不會(huì)影響基因組測(cè)序。”

“這項(xiàng)技術(shù)通過優(yōu)化，將能快速、高效地識(shí)別醫(yī)院和其他醫(yī)療場(chǎng)所中的細(xì)菌和病毒，具有很大的應(yīng)用潛力。而且這也將能提升序列的可信度，因?yàn)檫@一過程無需構(gòu)建文庫。” 我們希望無需建庫法可以在臨床診斷場(chǎng)合快速應(yīng)用起來。“比如從一根藥用棉簽中就可以找出到底病人身上有什么樣的抗生素抗性基因。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)2、生物通往期文章1/2/3。

Harold Swerdlow：

無需建庫法能直接利用非常有限的DNA樣品，但同時(shí)也需要你在通量上做出一些放棄。“無需建庫法不適合那些需要得到很多Reads的項(xiàng)目，這是需要掌握的核心概念。但總有些項(xiàng)目你不需要這么多Reads，我們說這個(gè)技術(shù)可能目前還比較小眾，卻總有一天會(huì)在某些應(yīng)用上非常管用。”比如僅用了0.08%的覆蓋率我們就準(zhǔn)確鑒定出了一種植物病原菌。還有諸如疫情爆發(fā)、急性病檢測(cè)等一些需要快速鑒定的場(chǎng)合。法醫(yī)取證可能又是另一種情形，比較講究“證據(jù)鏈”。“法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中的樣品很容易污染或誤混合，但如果拿到樣品后直接測(cè)序，就不會(huì)有此類擔(dān)憂，證據(jù)鏈也得到了有力保障。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)2、生物通往期文章1/2/3/4/5。

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參考文獻(xiàn)

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10. 137-P: SINGLE MOLECULE REAL-TIME SEQUENCING OF FULL LENGTH HLA CLASS I GENES – THE PROMISE AND CURRENT REALITY Curt Lind, Kate Mackiewicz, Jamie Duke, Ariella Sasson, Swati Ranade, Anand Sethuraman, Jason Chin, Jeff Robinson, Dimitri Monos. Human Immunology. Volume 73, Supplement, October 2012, Pages 135. ASHI 2012 Puerto Rico Abstracts Issue.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0198885912004284

參考影像

1. Customer Story: Exploring the Genetics of Fragile X Syndrome, Paul Hagerman (UC Davis)
2. PacBio AGBT 2013 Eric Schadt
3. PacBio AGBT 2013 Korlach-Webinar
4. Virtual Poster – Barcodes Allow for Sample Multiplexing with SMRT DNA Sequencing, Kevin Travers (Pacific Biosciences)
5. Virtual Poster – Evaluating the Potential of New Sequencing Technologies for Genotyping and Variation Discovery in Human Data, Mauricio Carneiro (Broad Institute)
6. Virtual Poster – Genome Variation in Chronic Viral Infection - SMRT Sequencing for HCV, Ellen Paxinos (Pacific Biosciences)
7. Virtual Poster – Single-Molecule HIV-1 Full Genome Sequence from Linked Transmission Pairs, Ellen Paxinos (Pacific Biosciences)
8. Webinar: Data Processing and Analytics for Follow-up Validation in Resequencing Projects, Mark DePristo (Broad Institute)
9. Webinar: Sequencing The Unsequenceable - Expanded CGG-repeat alleles of the fragile X gene, Paul Hagerman (UC Davis, School of Medicine)

生物通往期文章

1. PacBio RS第三代單分子測(cè)序系統(tǒng)全球訪談紀(jì)要（一）
2. PacBio RS第三代單分子測(cè)序系統(tǒng)全球訪談紀(jì)要（二）
3. PacBio RS第三代單分子測(cè)序系統(tǒng)全球訪談紀(jì)要（三）
4. PacBio堿基修飾分析標(biāo)識(shí)微生物、病原菌的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志
5. 單分子測(cè)序技術(shù)助力歐洲大腸桿菌研究
6. 單分子測(cè)序揭示艾滋病毒可變剪切新模式
7. 單分子測(cè)序助力脆性X綜合征的研究
8. 單分子測(cè)序助力髓母細(xì)胞瘤外顯子組測(cè)序研究
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10. 第三代測(cè)序：單分子測(cè)序在基因分型與突變驗(yàn)證中的應(yīng)用