PacBio第三代測序技術(shù)在De novo測序、Target測序以及DNA Modification等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，發(fā)揮的作用也越來越不可替代。而Broad研究院的科學(xué)家們更證明， PacBio RS不僅可以作為基因組研究手段，而且也是極好的基因分型、變異驗證與重復(fù)實驗的平臺（第三代測序：單分子測序在基因分型與突變驗證中的應(yīng)用）。

*近Nature雜志發(fā)表了一項關(guān)于髓母細(xì)胞瘤外顯子組測序的研究，在該研究中，麻省理工和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們利用PacBio平臺成功對Illumina Hiseq2000外顯子測序數(shù)據(jù)中的變異位點進(jìn)行了驗證分析。

科學(xué)家們首先用外顯子捕獲平臺結(jié)合illumina Hiseq2000完成了對92例髓母細(xì)胞瘤患者病灶/正常對的測序，分析出多個可能的點突變位點，然后利用PacBio平臺對48個外顯子的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行驗證分析，*終確認(rèn)了12個與髓母細(xì)胞瘤相關(guān)的變異，其中在RNA解旋酶基因DDX3X上的突變是以前從未發(fā)現(xiàn)的，為這種疾病的基礎(chǔ)研究和診斷提供了新的Marker。此外，科學(xué)家們對PacBio驗證數(shù)據(jù)與Hiseq2000數(shù)據(jù)的比對分析也證實，雖然PacBio單分測序容易產(chǎn)生較多的indel錯誤，但是其中大部分都是隨機性的，可以通過軟件進(jìn)行修正。

“盡管PacBio SMRT測序方法有著比較高的indel錯誤率，但是利用這個技術(shù)可以非常容易的對CTDNEP1基因中的2bp deletion突變與其他隨機indel突變進(jìn)行區(qū)分和識別”

Illumina Solexa平臺產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)多是150bp左右的短片段，需要利用復(fù)雜的生物信息學(xué)分析手段對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、定位、組裝等分析。而且測序片段過短容易產(chǎn)生定位錯誤等問題，依賴PCR的測序方式也會不可避免的引入系統(tǒng)性測序誤差從而產(chǎn)生較多的假陽性。因此，一般需要利用另一種準(zhǔn)確度更高的方法對其產(chǎn)生的變異數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗證。Sequenom質(zhì)譜法和Sanger測序方法無疑是驗證的金標(biāo)準(zhǔn)，不過質(zhì)譜法無法探尋未知位點，Sanger測序通量低又容易引入人為誤差。PacBio RS測序技術(shù)具有單分子的分辨率，不引入PCR過程，其CCS測序模式所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度非常高，可以對基因組中的低頻變異進(jìn)行高效的釋讀，而且單分子測序的讀長長，可以尋找除已知位點以外的其他漏檢稀有突變，有效彌補Sequenom和Sanger方法的缺陷。

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第三代測序：單分子測序在基因分型與突變驗證中的應(yīng)用  

生物通推薦原文摘要：

Medulloblastoma exome sequencing uncovers subtype-specific somatic mutations

Medulloblastomas are the most common malignant brain tumours in children 1. Identifying and understanding the genetic events that drive these tumours is critical for the development of more effective diagnostic, prognostic and therapeutic strategies. Recently, our group and others described distinct molecular subtypes of medulloblastoma on the basis of transcriptional and copy number profiles. Here we use whole-exome hybrid capture and deep sequencing to identify somatic mutations across the coding regions of 92 primarymedulloblastoma/normal pairs. Overall, medulloblastomas have low mutation rates consistent with other paediatric tumours, with  a mdian of 0.35 non-silent mutations per megabase. We identified twelve genes mutated at statistically significant frequencies, including previously known mutated genes in medulloblastoma such as CTNNB1,PTCH1,MLL2,SMARCA4 and TP53. Recurrent somatic mutations were newly identified in an RNA helicase gene,DDX3X,often concurrent with CTNNB1 mutations, and in the nuclear co-repressor (N-CoR) complex genes GPS2,BCOR and LDB1. We show that mutant DDX3X potentiates transactivation of a TCF promoter and enhances cell viability in combination with mutant,but not wild-type, b-catenin. Together, our study reveals the alteration of WNT, hedgehog, histone methyltransferase and now N-CoR pathways across medulloblastomas and within specific subtypes of this disease, and nominates the RNA helicase DDX3X as a component of pathogenic b-catenin signalling in medulloblastoma.