導言
       導言：號稱第三代的單分子測序技術，又是一個劃時代的新里程碑，必將為研究開辟出新的領域和思路，不可錯過�？上�PacBio廠家公開的技術講座今年四月在國內(nèi)只得2場，講座實況暫不允許公開，故生物通編者整理了一份詳盡的講座筆記并稍作調(diào)整補充，以饗讀者。

技術原理

關鍵點之一：DNA聚合酶        DNA聚合酶和模板結合，4色熒光標記4種堿基，經(jīng)過Watson配對后不同的堿基加入，會發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。這個DNA聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關鍵之一，讀長主要跟酶的活性保持有關，主要受激光對它的損傷的影響。PacBio還在不斷優(yōu)化聚合酶的性能，比如給聚合酶加上免受激光影響的保護基團等，進一步地提高讀長，提高測序質(zhì)量和通量。詳細

單個ZMW底部固定有一個結合了模板DNA的聚合酶，當加入測序反應試劑后，每個堿基配對合成后會發(fā)出相應的光并被檢測。一個SMRTCell中有15萬個ZMW，每個孔中有一個單分子DNA鏈在高速合成，如眾星閃爍。原始檢測數(shù)據(jù)的結果，每合成一個堿基即顯示為一個脈沖峰，每分鐘>100個堿基的速度，配上高分辨率的光學檢測系統(tǒng)，就能實時檢進行檢測。

關鍵點之二：熒光標記位點        二代測序都標記在5‘端甲基上，在合成過程中，熒光標記物保留在DNA鏈上，隨DNA鏈的延伸會產(chǎn)生三維空間阻力導致DNA鏈延長到一定程度后會出現(xiàn)錯讀。這是NGS的測序讀長僅能達到100多bp到200bp的一個原因。        PacBio平臺的堿基熒光標記在3‘端磷酸鍵。在DNA合成過程中正確的堿基進入時，在3’端磷酸鍵的標記是會隨磷酸鍵斷裂自動被打斷，標記物被棄去，亦即合成的DNA鏈不帶熒光標記，和天然的DNA鏈合成產(chǎn)物一致，可以達到很長的讀長。詳細

關鍵點之三：時空段概念        合成過程中，每次進入一個堿基，原始數(shù)據(jù)會實時地產(chǎn)生一個脈沖峰，每兩個相鄰的脈沖峰之間有一定的距離，也就是有一個時間段的概念。這個距離的長短與模板上堿基是否存在修飾有關，如果有堿基修飾，就像開車經(jīng)過路障時，通過速度會減慢，導致兩個相鄰峰之間距離加大。根據(jù)這個距離的變化，可以判斷模板相應位點是否出現(xiàn)堿基修飾，并且結果是實時的。甲基化就是一種主要的堿基修飾，PacBio技術不僅可以提供序列信息，還可提供實時信息了解模板修飾的情況，用于甲基化等堿基修飾研究。詳細

測序流程和策略

1. 文庫制備 材料：全基因組DNA，或者cDNA，或者目標擴增產(chǎn)物 片段化：全基因組太大需要片段化，因為測序讀長很長，可以做很大的片段文庫（3-10kb） 連接：先把片段粘末端變成平端，兩端分別連接環(huán)狀單鏈：單鏈兩端分別與雙鏈正負鏈連接上，得到一個類似啞鈴（“套馬環(huán)”）的結構，稱為SMRT Bell。連接半小時內(nèi)完成。 2. 引物退火 + 聚合酶結合 當引物與模板的單鏈環(huán)部位退火后，這個雙鏈部位就可以結合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。 3. 測序策略        萬事俱備，一旦向反應中加入正常的離子，DNA聚合反應開始了。模板雙鏈打開成環(huán)形，先合成正鏈，單鏈區(qū)，跟著合成負鏈。聚合酶每合成一圈，對于定向目標序列，就相當于2x覆蓋度。由于合成產(chǎn)物和天然產(chǎn)物一致，聚合酶可以持續(xù)合成很長很長的產(chǎn)物，亦即循環(huán)合成很多圈（重復多次），對于定向單分子目標序列來說就可以得到很高的覆蓋度，即獲得很多subread，這就意味著可以對非常低的頻率的片段獲得很高的準確度，這稱為環(huán)形一致序列（circle consensus）模式，該模式適用于稀有突變及需要高精確度的測序。這也是單分子測序能比NGS靈敏度更高地，高準確度地檢測到稀有突變的原理。詳細

技術應用
PacBio單分子測序的技術特征如下：

• 超長的讀長——de novo測序中完整基因組的組裝；Target測序中多個突變位點的單倍體型檢測，復雜的多個重復片段的準確測定，長轉(zhuǎn)錄本及可變剪切體測定等等
• 超高測序準確度及單分子分辨率——特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定
• 動態(tài)信息——可獲得甲基化等多種堿基修飾信息

超長的讀長        二代測序的短處在于讀長太短。就像拼圖游戲，越碎的碎片就越難拼接。雖然提供海量的數(shù)據(jù)，但是依然不足以完成全基因組拼接。去年在Nature上發(fā)表的一篇綜述文章指出，二代測序讀長太短是其技術的內(nèi)有問題（fundamental data properties），數(shù)學模式所不能解決的。算法已經(jīng)很成熟，算法再好，也不足以解決這個問題。        PacBio的超長讀長，可實現(xiàn)以相對較低的覆蓋度達到很好的序列組裝。有助于產(chǎn)生較少的重疊群，幫助全基因組組裝。還可以獲得復雜的DNA重組信息，比如由于斷裂造成的融合基因的Breakpoint，cDNA里包含的剪切，內(nèi)外顯子間的關系，都需要很長的讀長幫助組裝跨越的區(qū)域。        因此，對于全基因組de novo測序來說，更適宜用組合的方法，將第三代和第二代測序方式結合。冷泉港去年宣布研發(fā)一個軟件，能將PacBio結果和二代測序結果結合。三代測序的超長讀長，加上二代測序的海量數(shù)據(jù)（價格低廉），應該是比較好的組合。詳細 定向測序中的SNP檢測        高精確，可做稀有SNP的檢測�？梢詸z測多個SNP的單倍體型，即兩個臨近的SNP在同一鏈上還是在不同鏈上。由于GC含量不影響單分子測序，片段讀長長，可將靶片段準確定位到參考序列上，加上單分子測序的錯誤隨機，沒有PCR引入的偏向性系統(tǒng)誤差，很容易通過提高覆蓋度得到高準確的的數(shù)據(jù)。Broad研究院經(jīng)過實驗對比得出的結論，PacBio做SNP檢測假陽性率低，在后續(xù)的SNP驗證上是最好的技術手段，該論文即將在Nature Methods上發(fā)表。 觀看視頻：Pacbio RS在發(fā)現(xiàn)或確認SNP中的優(yōu)勢

動態(tài)信息        PacBio在與對德國大腸桿菌爆發(fā)事件中的爆發(fā)株進行de novo測序組裝之后，又邀請New England Biolabs公司協(xié)助對該大腸桿菌株測序結果進行甲基化方面的生物信息學分析。結果表明該基因組上確實有很多甲基化出現(xiàn)（約45000個）。通過排除法，發(fā)現(xiàn)爆發(fā)株里有CTGCAG motif特有的甲基化，還發(fā)現(xiàn)插入的外源序列中還有一段序列類似甲基化酶，可專門對CTGCAG的序列進行甲基化。對CTGCAG甲基化有關的基因表達分析，發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的基因包括菌毛，鞭毛體和與細胞注入有關的基因，這些結果也許可能解釋為嗜菌體侵染而注入一段外源基因，其中包含一種甲基化酶，導致爆發(fā)株表達改變，提高對宿主吸附性，連同志賀毒素，而導致毒性升高。        由此可見，正由于Pacbio的第三代測序系統(tǒng)得到堿基序列信息的同時獲得了堿基修飾的信息，我們可同時對堿基序列和堿基修飾兩方面測序信息進行分析，可以完整解釋爆發(fā)株的強毒性的基因組機制，為表觀遺傳學及疾病基因組學開辟了新的研究思路。詳細 白血病中的突變檢測實例        FLT3過去一直被認為是急性髓細胞白血病（AML）的有效治療靶標，可患者接受靶向FLT3新藥治療后若復發(fā)會產(chǎn)生耐藥性，導致科學界對FLT3是否是真正有效靶標產(chǎn)生質(zhì)疑。FLT3呈受體結構，有一段激酶區(qū)域，還有一段稱為ITD的重復序列，ITD上有很多突變，是過去藥物篩選的靶標。最新這項研究試圖發(fā)現(xiàn)ITD突變外部的二級突變與抗藥性的關系。        研究發(fā)現(xiàn)ITD外部下游區(qū)也有很多二級突變產(chǎn)生，和抗藥性有關。二級突變產(chǎn)生的頻率很低，很難找到，所以不受重視，在很多研究中，也沒有將其與抗藥性關聯(lián)起來。這些二級突變的長度超過1kb，故二代測序是測不到的。PacBio技術正好可以很容易解決這個問題。結果表明，在沒用藥前，ITD下游二級突變出現(xiàn)頻率不高，但用藥后二級突變出現(xiàn)頻率升高。8個例子中，不同的病人出現(xiàn)突變的頻率和模式是不同的，其中有的突變頻率很低，不到3%。正是由于第三代測序?qū)﹂L片段及稀有突變的高靈敏度高準確度檢測，重新證實了FLT3的確是有效的藥物靶標。詳細

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第三代測序系統(tǒng)PacBio RS（2011年12月）