生物通編者按：技術講座就像seminar，能在短短數十分鐘內，將一種新技術的原理、應用和前景解釋得清清楚楚，聽得明白又省時。號稱第三代的單分子測序技術，又是一個劃時代的新里程碑，必將為研究開辟出新的領域和思路，不可錯過。可惜PacBio廠家公開的技術講座今年四月在國內只得2場，講座實況暫時不允許公開，生物通編者整理了一份詳盡的講座筆記并稍作調整補充，以饗讀者。

一 技術原理

SMRT：single molecular real time Sequencing
PacBio RS，RS表示Real time Sequencing

單分子測序的關鍵之一：DNA聚合酶

基本原理：DNA聚合酶和模板結合，4色熒光標記4種堿基，經過Watson配對后不同的堿基加入，會發出不同光，根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。這個DNA聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一，讀長主要跟酶的活性保持有關，主要受激光對它的損傷的影響。PacBio還在不斷優化聚合酶的性能，比如給聚合酶加上免受激光影響的保護基團等，進一步地提高讀長，提高測序質量和通量。

    和其他基本測序技術一樣，在反應管中進行的是大規模平行的多分子反應，怎樣在其中進行單分子反應檢測？周圍有大量的熒光標記的游離堿基，怎樣將反應信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區別出來？

    通過一個物理現象解釋：ZMW（zero-mode waveguides，零模波導孔）。例如微波爐壁上可看到有很多密集的小孔。小孔直徑有考究，如果直徑大于微波波長，能量就會穿透面板泄露。如果孔徑小于波長，能量不會輻射外部，可起保護作用。

 

    同理，在一個反應管（SMRTCell：單分子實時反應孔）中有許多這樣的圓形納米小孔，即ZMW（零模波導孔），外徑100多納米，比檢測激光波長小（數百納米），激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區，能量被限制在一個小范圍（體積20X 10^-21 L）里，正好足夠覆蓋需要檢測的部分，使得信號僅來自這個小反應區域，孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中，將背景降到最低。

    單個ZMW底部固定有一個結合了模板DNA的聚合酶，當加入測序反應試劑后，每個堿基配對合成后會發出相應的光并被檢測。一個SMRTCell中有15萬個ZMW，每個孔中有一個單分子DNA鏈在高速合成，如眾星閃爍。原始檢測數據的結果，每合成一個堿基即顯示為一個脈沖峰，每分鐘>100個堿基的速度，配上高分辨率的光學檢測系統，就能實時檢進行檢測。

關鍵點之二：熒光標記位點。這是影響測序長度的非常關鍵的因素。
   
    二代測序都標記在5‘端甲基上，在合成過程中，熒光標記物保留在DNA鏈上，隨DNA鏈的延伸會產生三維空間阻力導致DNA鏈延長到一定程度后會出現錯讀。這是NGS的測序讀長僅能達到100多bp到200bp的一個原因。

    PacBio平臺的堿基熒光標記在3‘端磷酸鍵。在DNA合成過程中正確的堿基進入時，在3’端磷酸鍵的標記是會隨磷酸鍵斷裂自動被打斷，標記物被棄去，亦即合成的DNA鏈不帶熒光標記，和天然的DNA鏈合成產物一致，可以達到很長的讀長。

（筆者疑問：是不是NGS改用5‘端標記，就能實現延長讀長？
答：首先，熒光標記在3‘端磷酸鍵是PacBio的專利。其它公司沒法做。熒光標記位點僅僅是影響讀長的一個重要因素之一，PacBio的單分子實時測序反應是最接近天然狀態的聚合酶反應體系，最大限度地保持了聚合酶的活性。NGS測序反應原理不盡相同，有的是焦磷酸測序反應，除聚合酶外有多種酶參與測序反應， 要兼顧多種酶的活力并容非一件易的事；有的是通過添加保護基團來控制堿基的加入和檢測，通過淬滅試劑來消除背景熒光和保護基團，這些都增加了測序反應體系本身的復雜性，此外，NGS每加入一種堿基或一個堿基后都需要清洗步驟清除沒有反應的多余反應物及反應產生的次級產物，這都影響了聚合酶的合成進程。）
 
關鍵點之三：時空段概念
   
    合成過程中，每次進入一個堿基，原始數據會實時地產生一個脈沖峰，每兩個相鄰的脈沖峰之間有一定的距離，也就是有一個時間段的概念。這個距離的長短與模板上堿基是否存在修飾有關，如果有堿基修飾，就像開車經過路障時，通過速度會減慢，導致兩個相鄰峰之間距離加大。根據這個距離的變化，可以判斷模板相應位點是否出現堿基修飾，并且結果是實時的。甲基化就是一種主要的堿基修飾，PacBio技術不僅可以提供序列信息，還可提供實時信息了解模板修飾的情況，用于甲基化等堿基修飾研究。

二 測序流程和策略

配件：SMRT cell chip（小拇指指甲蓋大小）。一條strip可以放8個SMRT cell，儀器一次可運行2條strip，共16個SMRT cell
文庫構建試劑盒，測序試劑盒

流程和策略

1. 文庫制備

材料：全基因組DNA，或者cDNA，或者目標擴增產物

片段化：全基因組太大需要片段化，因為測序讀長很長，可以做很大的片段文庫（3-10kb）

連接：先把片段粘末端變成平端，兩端分別連接環狀單鏈：單鏈兩端分別與雙鏈正負鏈連接上，得到一個類似啞鈴（“套馬環”）的結構，稱為SMRT Bell。連接半小時內完成。（問題：片段化用什么方法？兩端的環狀單鏈是同一序列嗎？如何確定單鏈方向？如果兩端一樣，如何分辨正負鏈？如何排除其他連接產物？連接效率有多高？如何純化去掉酶？答：關于以上文庫制備問題跟NGS類似，比如用片段化儀進行片段化，加接頭等等。通過優化的實驗protocol進行各步驟的優化。 ）

    如此，文庫制備完成，簡單快速。無需擴增。沒有擴增偏向性，高或低GC含量區域覆蓋均勻，尤其不會湮沒稀有突變。

 

2 引物退火 + 聚合酶結合
   
    當引物與模板的單鏈環部位退火后，這個雙鏈部位就可以結合到已固定在ZWM底部的聚合酶上（問題：大分子DNA進入小孔的擴散速度？是否會存在有的ZMW沒有模板進入的情況？答：SMRTCell中樣本和測序反應體系的配置都是在測序儀中程序化自動完成的，簡單快捷，標準化。會，目前的通量基于目前的進入效率，因此這方面還有提高的空間）。

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3. 測序策略

    萬事俱備，一旦向反應中加入正常的離子，DNA聚合反應開始了。模板雙鏈打開成環形，先合成正鏈，單鏈區，跟著合成負鏈。聚合酶每合成一圈，對于定向目標序列，就相當于2x覆蓋度。由于合成產物和天然產物一致，聚合酶可以持續合成很長很長的產物，亦即循環合成很多圈（重復多次），對于定向單分子目標序列來說就可以得到很高的覆蓋度，即獲得很多subread，這就意味著可以對非常低的頻率的片段獲得很高的準確度，這稱為環形一致序列（circle consensus）模式，該模式適用于稀有突變及需要高精確度的測序。這也是單分子測序能比NGS靈敏度更高地，高準確度地檢測到稀有突變的原理。

除了特有的環形一致序列（circle consensus）模式外，也可以通過增加同一序列的覆蓋度（在不同ZMW中）獲取高的一致性準確度。

單分子覆蓋度和獲取序列一致性準確度的關系

QV 10代表90%準確度，20代表99%準確度，30代表99.9%準確度，40代表99.99%準確度，50代表99.999%準確度。由圖可見，5個單分子疊加可以得到99%準確度，10個單分子疊加可以得到99.9%準確度，15個單分子疊加可以得到99.99%，20個單分子疊加可以得到5個9的準確度。。。類推。而對于因此可以看出，利用環形一致序列模式這個策略，對同一單分子就可以得到非常非常高的準確度。

聽眾提問：關于準確度差的說法如何解釋？回答補充于此：準確率這個概念本身就是指序列一致性，無論一代和二代測序的每一個反應，本來就是N個分子同時疊加反應所得到的平均信號，是一致性序列的結果。 單分子測序1ｘ覆蓋度的精確度為87.5％，這是由于在測序過程中單個分子信號弱，偶爾會出現信號難于分辨的情況。出錯幾率是隨機的，和序列長度、序列組成無關。要提高準確率，只需要提高循環次數，提高單分子覆蓋度即可，15個單分子疊加可以得到99.99％的精確度，20個單分子疊加可以得到5個9的準確度，這將是二代測序難以企及的。 （問題：用PCR擴增結果測序是否能通過提高重復拷貝數而提高覆蓋度，從而同時達到長片段和高度精確的目的？答：是，可以通過提高重復拷貝數或對同一單分子環形測序兩種方式，或二者結合，達到要求的覆蓋度及準確度。）

如果需要很長的讀取，策略是構建3 kb-10 kb的文庫，就可以獲得長的讀長，這就是continuous longread模式。這種模式，很長的讀長適合做全基因組序列組裝骨架。

讀長分布圖。平均讀長3.1kb，top 5% 讀長大于8kb，最長讀長14.7kb。目前有標準的protocol，長片段測序推薦為90min。

三 技術應用

一種新技術的應用，通常倚借其技術特長的優勢。

PacBio單分子測序的技術特征

• 超長的讀長——de novo測序中完整基因組的組裝； Target測序中多個突變位點的單倍體型檢測，復雜的多個重復片段的準確測定，長轉錄本及可變剪切體測定等等
  
• 超高測序準確度及單分子分辨率——特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定
  
• 動態信息——可獲得甲基化等多種堿基修飾信息

超長的讀長   

    二代測序的短處在于讀長太短。就像拼圖游戲，越碎的碎片就越難拼接。雖然提供海量的數據，但是依然不足以完成全基因組拼接。去年在Nature上發表的一篇綜述文章指出，二代測序讀長太短是其技術的內有問題（fundamental data properties），數學模式所不能解決的。算法已經很成熟，算法再好，也不足以解決這個問題。

    PacBio的超長讀長，可實現以相對較低的覆蓋度達到很好的序列組裝。有助于產生較少的重疊群，幫助全基因組組裝。還可以獲得復雜的DNA重組信息，比如由于斷裂造成的融合基因的Breakpoint，cDNA里包含的剪切，內外顯子間的關系，都需要很長的讀長幫助組裝跨越的區域。

    因此，對于全基因組de novo測序來說，更適宜用組合的方法，將第三代和第二代測序方式結合。冷泉港去年宣布研發一個軟件，能將PacBio結果和二代測序結果結合。（三代測序的超長讀長，加上二代測序的海量數據（價格低廉），應該是比較好的組合。聽眾提問：為什么PacBio通量比二代測序低？回答補充于此：一個SMRT Cell的ZMW只有15萬個，提高ZMW可以提到數據產量，提高酶耐受激光的能力也將有助于提高讀長并最后提高數據產量。目前一天運行16個SMRT Cell 可產生的原始數據能達到6.4G（400M/cell計算），但單分子測序的優勢在于長讀長而不是通量。）

舉例：
美國能源部對一個微生物進行測序，用二代測序最好的結果可以組裝得到58個重疊群contig.，而用PacBio可以直接得到一個contig，一步完成全基因組組裝。

美國農業部對羊體內微生物進行測序。用二代測序沒能組裝起全基因組，最少也有18個contig。用PacBio，用6K長度21x覆蓋度，可以組裝成單個contig。這說明長序列測序確實可以幫助組裝。

另外一個重要問題，GC%對測序覆蓋度的影響：對于二代測序技術，GC含量高的地方覆蓋度低，即使再提高全基因組覆蓋度，但富含GC的區域覆蓋度還是難以提高，無法填補。這就造成用二代測序很難完成一些物種的全基因組測序的原因，或者有的全基因組測序結果存在不少gap的原因。

單分子測序平臺很適合困難基因組的測序，比如GC含量很高，AT含量很高，多堿基串聯重復（如CGG重復），普通測序技術很難獲得結果。這個平臺對這類很難測序的區域都能平穩的測序。單分子測序結果顯示這種技術覆蓋度不隨GC含量變化而變化，曲線平穩。均一的覆蓋度對全基因組測序的完成非常重要。

舉例，全長cDNA測序結果。5’端轉錄本開始，4號外顯子，5號外顯子，3‘UTR，polyA區。polyA區域100多個A的測序峰非常清晰。然后到套馬環區，然后到PolyT 區。。。能測長PolyA對研究RNA的代謝有重要意義，RNA的半衰期和PolyA長度有關，對其穩定性很有意義。

中心粒測序：中心粒的一段序列有很高重復，用Sanger和二代測序都很難得到結果，用PacBio能夠完成。
脆性X綜合癥的大量重復的CGG序列都可以測序。
     
動態信息——可獲得甲基化等修飾信息的例子
   
PacBio提供實時的測序，一能提供測序結果，即堿基的排列組合，二是可以提供基因修飾的信息（PacBio技術對甲基化的檢測可參考Nature Method發表的一篇文章）——其原理在于，當聚合酶合成每一個堿基，都有一個時間段，兩個相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離可以算一個比值，稱為IPD。當模板堿基帶有修飾時，聚合酶會慢下來，就像行車過程中遇到路障。兩個相鄰的脈沖峰之間的距離就會延長。當看到某個堿基IPD比例明顯大于1時，就可以推斷這個位置有修飾。

德國致命性大腸桿菌爆發事件

由于食物污染了致命性大腸桿菌而導致數千人出現了腸出血性急性腹瀉，導致50人死亡。3個研究小組分別對該事件中的爆發性大腸桿菌進行測序，來分析其基因型。

了解PacBio測序系統的最新應用

德國小組采用二代測序，2個樣本，參照序列比對測序，聚類分析結果得出是EHEC亞型。

華大小組用另一種二代測序技術進行de novo測序，測序結果發表在新英格蘭雜志上，找到了大腸桿菌中出現的外源序列和志賀毒素，論文討論部分提出，即使找到志賀毒素，也不能完全解釋為什么會導致該大腸桿菌株有如此強的毒性。

PacBio與哈佛大學合作，對2711爆發株進行的de novo測序組裝。證實是EAEC亞型，結果發表在同一期的新英格蘭雜志。測序結果也發現基因組出現了一個外源嗜菌體帶入的一段基因，上面有志賀毒素基因。（詳細報道：http://m.beijingyunkai.cn/newsf/2011-8/2011810172027853.htm）

PacBio小組邀請New England Biolabs公司協助對該大腸桿菌株測序結果進行甲基化方面的生物信息學分析。結果表明該基因組上確實有很多甲基化出現（約45000個）。通過排除法，發現爆發株里有CTGCAG motif特有的甲基化，還發現插入的外源序列中還有一段序列類似甲基化酶，可專門對CTGCAG的序列進行甲基化。對CTGCAG甲基化有關的基因表達分析，發現表達上調的基因包括菌毛，鞭毛體和與細胞注入有關的基因，這些結果也許可能解釋為嗜菌體侵染而注入一段外源基因，其中包含一種甲基化酶，導致爆發株表達改變，提高對宿主吸附性，連同志賀毒素，而導致毒性升高。最后功能學實驗證明，將該爆發株注入兔子，同樣出現出血性腹瀉癥狀，而當基因敲除這個甲基化酶，再注入兔子，癥狀消失。由此可見，正由于Pacbio的第三代測序系統得到堿基序列信息的同時獲得了堿基修飾的信息，我們可同時對堿基序列和堿基修飾兩方面測序信息進行分析，可以完整解釋爆發株的強毒性的基因組機制，為表觀遺傳學及疾病基因組學開辟了新的研究思路。目前該論文正在接受評議之中。大家可以通過以下廠家網站鏈接觀看關于E.Coli O104爆發株研究的最新系列視頻報道，先睹為快。

http://aa314.o1.gondor.io/webinar/uncovering-novel-regulatory-mechanisms-via-a-more-complete-characterization-of-dna-variation/

5hmC的檢測

5hmC——非常重要的表觀標記，被譽為第6個堿基。是細胞分化和組織發育中的重要的標記。在PacBio測序過程中發現IPD峰值不夠明顯，需要對其進行富集修飾。經過富集和修飾的序列測序結果可以顯著檢測出5hmC，甚至還可以檢測到單鏈上（另一鏈不含）出現的5hmC（hemi-）。PacBio技術的獨到之處在于：不單可以區分5mC 和5hmC，還能識別其位于DNA的哪一條鏈上。（詳細報道：http://m.beijingyunkai.cn/newsf/2011-11/20111123171704271.htm）

超高測序準確度及單分子分辨率——特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定

定向測序中的SNP檢測 

高精確，可做稀有SNP的檢測。可以檢測多個SNP的單倍體型   ，即兩個臨近的SNP在同一鏈上還是在不同鏈上。由于GC含量不影響單分子測序，片段讀長長，可將靶片段準確定位到參考序列上，加上單分子測序的錯誤隨機，沒有PCR引入的偏向性系統誤差，很容易通過提高覆蓋度得到高準確的的數據。Broad研究院經過實驗對比得出的結論，PacBio做SNP檢測假陽性率低，在后續的SNP驗證上是最好的技術手段，該論文即將在Nature Methods上發表，可以先觀看以下Broad在今年的AGBT上的相關報道視頻：

http://i.youku.com/u/UMTQ2NjcwMTEy/videos

白血病中的突變檢測實例
   
這是數天前（4月15日）發表在Nature上的一篇文章。FLT3過去一直被認為是急性髓細胞白血病（AML）的有效治療靶標，可患者接受靶向FLT3新藥治療后若復發會產生耐藥性，導致科學界對FLT3是否是真正有效靶標產生質疑。

FLT3呈受體結構，有一段激酶區域，還有一段稱為ITD的重復序列，ITD上有很多突變，是過去藥物篩選的靶標。最新這項研究試圖發現ITD突變外部的二級突變與抗藥性的關系。

兩個基因融合突變造成酪氨酸激酶通路產生的失調。其中一個基因突變會產生二級突變，這種突變會導致病人對激酶抑制劑藥物產生抗藥性。激酶區域突變有兩種不同方式產生，一種是polycolonal突變，另一種是compound 方式產生。不同的突變方式導致對不同藥物的不同抗藥性。需要有好的方法在臨床上區分兩種突變產生以個性化用藥。

研究發現ITD外部下游區也有很多二級突變產生，和抗藥性有關。二級突變產生的頻率很低，很難找到，所以不受重視，在很多研究中，也沒有將其與抗藥性關聯起來。這些二級突變的長度超過1kb，故二代測序是測不到的。傳統Sanger技術雖然可以了解突變的空間關系，但處理起來非常麻煩，還需要擴增，挑克隆。PacBio技術正好可以很容易解決這個問題。結果表明，在沒用藥前，ITD下游二級突變出現頻率不高，但用藥后二級突變出現頻率升高。8個例子中，不同的病人出現突變的頻率和模式是不同的，其中有的突變頻率很低，不到3%。正是由于第三代測序對長片段及稀有突變的高靈敏度高準確度檢測，重新證實了FLT3的確是有效的藥物靶標。（詳細報道：http://m.beijingyunkai.cn/newsf/2012-4/2012418155854183.htm）

登錄Pacbio網站首頁（http://www.pacificbiosciences.com/），點擊左下角“Resent News”欄相關鏈接可索取該文的e-print版本及相關信息。

脆性X綜合癥

脆性X綜合征是一種遺傳性綜合征，伴隨著X染色體上一段三核苷酸序列（CGG）的重復擴增。這種擴增導致了一種稱為FMR1的蛋白質無法在病人體內表達，而該蛋白質是神經正常發育所必需的。如果一個人含有45-54個重復序列，則被認為是“灰色地帶”，而55-200個重復序列被稱為前突變，會導致產生RNA毒性，脆性X相關性震顫/共濟失調綜合征（FXTAS），一種以意向性震顫、步態共濟失調和其他癥狀為特征的遲發性神經變性疾病；200個以上重復序列則被稱為全突變，沒有成熟的RNA產生，沒有功能的蛋白產生。因而CGG重復的個數，會產生不同的臨床表征。一代和二代測序技術對于大量擴增的CGG重復（>100）只能生成不連貫的信號，阻礙了研究人員獲得單堿基分辨率的測序數據。美國加州大學Davis分校利用單分子測序技術可清楚得測出上游重復序列的個數，另外還發現CGG超過150拷貝以上，整個區域會突然被全部甲基化，這或許為致病機制研究提供了新的線索。（詳細報道：http://m.beijingyunkai.cn/newsf/2011-11/20111110101650521.htm）

有趣的其他應用例子（尚在研發中…）

真正的RNA測序：
   
在這個技術平臺上，如果將DNA聚合酶換成RNA反轉錄酶，就可以直接對RNA進行測序（不通過cDNA），還可以檢測RNA上堿基的分子修飾。這將打開一個全新的研究思路。
圖示：1kb測序結果。現在的工作在優化RNA反轉錄酶。（直接的RNA測序！確實是個有趣的想法！）

其他聚合反應
   
只要是聚合反應，都有機會應用在這個平臺上，例如把Ribosome固定在ZMW上，提供tRNA，就有可能進行蛋白質合成研究。PacBio系統有很高的擴展靈活性。

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