CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了生物學(xué)領(lǐng)域，也迅速成為許多實(shí)驗(yàn)室的必備工具。這種編輯技術(shù)不僅可以用在基因敲除（knockout），也可以用于基因敲入（knockin），也就是在目標(biāo)位點(diǎn)精確引入一段DNA序列，以便產(chǎn)生特定突變或插入新元件。這是通過DNA雙鏈斷裂后的同源定向修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

大家都知道，在真核細(xì)胞中，DNA雙鏈斷裂的修復(fù)機(jī)制主要有兩種：非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復(fù)（HDR）。HDR被認(rèn)為是更準(zhǔn)確的斷裂修復(fù)機(jī)制，但它需要修復(fù)模板的存在，同時(shí)要求受損DNA和供體DNA鏈之間具有更高的序列同源性。

也許有人要問：我應(yīng)該使用哪種修復(fù)模板，雙鏈DNA還是單鏈DNA？其實(shí)，這取決于您想要實(shí)現(xiàn)的修飾。若希望引入較小的修飾，如單點(diǎn)突變或50 bp以下的突變，那么單鏈DNA是個(gè)很好的選擇。若希望插入較大的片段，比如熒光蛋白或選擇元件，那么就需要較長(zhǎng)的DNA供體。這個(gè)供體可以是雙鏈DNA，也可以是單鏈DNA。

不過，需要注意的是，雙鏈DNA存在隨機(jī)整合到基因組上的風(fēng)險(xiǎn)，因此在精確的基因編輯上的應(yīng)用非常有限。相比之下，單鏈DNA隨機(jī)整合的風(fēng)險(xiǎn)大大降低，主要是插入Cas9/sgRNA復(fù)合物所靶定的位點(diǎn)。此外，單鏈DNA供體模板對(duì)細(xì)胞的毒性要遠(yuǎn)低于雙鏈DNA模板。

盡管單鏈DNA的優(yōu)點(diǎn)多多，但它的制備難度較大，費(fèi)用也頗高。以往，人們只能經(jīng)濟(jì)、無誤地合成200 bp以下的單鏈DNA。一旦超過了這個(gè)長(zhǎng)度，單鏈DNA的合成就變得非常昂貴，也容易出錯(cuò)。好在，Takara旗下的Clontech品牌近日推出了Guide-it Long ssDNA Strandase Kit，可制備長(zhǎng)達(dá)5 kb的單鏈DNA寡核苷酸。

這個(gè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)便的方法來制備CRISPR/Cas9或者其它基因編輯技術(shù)的基因敲入實(shí)驗(yàn)修復(fù)模板。它選擇地消化降解雙鏈DNA PCR產(chǎn)物的正義鏈（sense strand）或者反義鏈（antisense strand），將其轉(zhuǎn)化為單鏈DNA。

具體的制備過程如下（圖1）。首先，通過合適的方法（克隆、融合PCR等）制備dsDNA起始模板，dsDNA模板包含與目的插入位點(diǎn)兩側(cè)同源的同源臂，模板中間是欲knockin的外源序列。然后，在dsDNA的不同位置上結(jié)合磷酸化的引物，制備出兩種不同的dsDNA作為Strandase反應(yīng)的底物。添加Strandase Mix A，開始消化正義鏈或反義鏈。接著，添加Strandase Mix B完成降解反應(yīng)，從而獲得ssDNA。最后，純化ssDNA產(chǎn)物用于knockin實(shí)驗(yàn)。Clontech專家建議，同時(shí)制備ssDNA正義鏈和反義鏈并獨(dú)立用于knockin實(shí)驗(yàn)。

 
圖1. 長(zhǎng)單鏈DNA（long ssDNA）供體模板制備步驟示意圖。

至于ssDNA作為修復(fù)模板，效果如何，是否隨機(jī)整合？研究人員也給出了詳細(xì)的答案。他們打算在HEK293細(xì)胞的GAPDH的C-末端定點(diǎn)敲入AcGFP1基因（圖2）。于是，他們?cè)O(shè)計(jì)的HDR供體模板的同源臂序列為GAPDH第8外顯子的末端序列，AcGFP1與GAPDH處于同一閱讀框（圖A）。之后，他們通過流式細(xì)胞術(shù)比較了dsDNA和ssDNA分別作為修復(fù)模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖B）。

結(jié)果顯示，以dsDNA作為修復(fù)模板時(shí)，即使沒有Cas9 RNPs，仍然出現(xiàn)相當(dāng)多的帶有綠色熒光的細(xì)胞克隆。然而，以長(zhǎng)ssDNA正義鏈或反義鏈作為修復(fù)模板時(shí)，只有同時(shí)加入Cas9和sgRNA，才會(huì)發(fā)生整合反應(yīng)；而沒有Cas9 RNPs時(shí)，則沒有檢測(cè)到熒光背景，說明不發(fā)生整合反應(yīng)。如此看來，ssDNA隨機(jī)整合的風(fēng)險(xiǎn)的確大大降低。

 
圖2. 在HEK293細(xì)胞的GAPDH的C-末端定點(diǎn)敲入AcGFP1基因。

此外，研究人員還比較了在knockin實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)入dsDNA和ssDNA所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。他們使用Cellartis hiPSC18細(xì)胞系。插入序列為AcGFP1，其作用是用于標(biāo)記tubulin。結(jié)果顯示，即使沒有加入Cas9，dsDNA的導(dǎo)入仍然可以引起顯著的細(xì)胞毒性。

 
圖3. 比較knockin實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)入dsDNA和ssDNA所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。

現(xiàn)在，您可以輕松愉快地制備ssDNA修復(fù)模板了吧，既不用擔(dān)心dsDNA的隨機(jī)整合，也無需憂慮dsDNA所帶來的細(xì)胞毒性。之后，ssDNA可通過電穿孔或試劑轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入細(xì)胞，具體要取決于您研究的細(xì)胞類型。

對(duì)于電穿孔方法，同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞的還有sgRNA（利用Guide-it sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備）以及Guide-it Recombinant Cas9。至于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，您可以選擇同時(shí)表達(dá)Cas9和sgRNA的一體化表達(dá)載體，比如Guide-it CRISPR/Cas9 System，與ssDNA共轉(zhuǎn)染。高大上的knockin實(shí)驗(yàn)，就是這么簡(jiǎn)單！（生物通 余亮）

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