生物通報(bào)道：新一代測(cè)序技術(shù)在爆炸式發(fā)展的同時(shí)，也衍生出許多其他技術(shù)創(chuàng)新。RNA深度測(cè)序（RNA-Seq）就是其中之一，這項(xiàng)技術(shù)使我們對(duì)細(xì)胞發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制的理解，達(dá)到了前所未有的深度和廣度。盡管研究細(xì)胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現(xiàn)大大拓展了轉(zhuǎn)錄組研究的規(guī)模，取得了累累碩果，這些是傳統(tǒng)技術(shù)難以企及的。

RNA-seq可以獲得相當(dāng)驚人的數(shù)據(jù)量，而這恰恰是一柄雙刃劍。豐富的數(shù)據(jù)量蘊(yùn)含著大量的寶貴信息，但這樣的數(shù)據(jù)需要復(fù)雜的生物信息學(xué)分析，才能從中提取到有意義的結(jié)果。正因如此，數(shù)據(jù)分析可以說是RNA-seq的重中之重。

RNA-seq有非常廣泛的應(yīng)用，但沒有哪個(gè)分析軟件是萬能的。科學(xué)家們一般會(huì)根據(jù)自己的研究對(duì)象和研究目標(biāo)，采用不同的數(shù)據(jù)分析策略。現(xiàn)在人們已經(jīng)發(fā)表了大量的RNA-seq和數(shù)據(jù)分析方案，對(duì)于剛?cè)腴T的新手來說難免有些無所適從。

佛羅里達(dá)大學(xué)、加州大學(xué)Irvine分校等單位的研究人員在一月二十六日的Genome Biology雜志上發(fā)表文章，概述了RNA-seq生物信息學(xué)分析的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和現(xiàn)有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNA-seq數(shù)據(jù)分析指南。這將成為開展RNA-seq研究的寶貴參考資料。

這份指南覆蓋了RNA-seq數(shù)據(jù)分析的所有主要步驟，比如質(zhì)量控制、讀段比對(duì)、基因和轉(zhuǎn)錄本定量、差異性基因表達(dá)、功能分析、基因融合檢測(cè)、eQTL圖譜分析等等。研究人員繪制的RNA-seq分析通用路線圖（標(biāo)準(zhǔn)Illumina測(cè)序），將主要分析步驟分為前期分析、核心分析和高級(jí)分析三類。前期預(yù)處理包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、測(cè)序設(shè)計(jì)和質(zhì)量控制。核心分析包括轉(zhuǎn)錄組圖譜分析、差異基因表達(dá)和功能分析。高級(jí)分析包括可視化、其他RNA-seq技術(shù)和數(shù)據(jù)整合。

研究人員在文章中探討了每個(gè)步驟所面臨的挑戰(zhàn)，也評(píng)估了一些數(shù)據(jù)處理方法的潛力和局限。此外，他們還介紹了RNA-seq數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)類型的整合。這種數(shù)據(jù)整合可以將基因表達(dá)調(diào)控與分子生理學(xué)和功能基因組學(xué)關(guān)聯(lián)起來，如今越來越受到研究者的歡迎。

這篇文章在結(jié)尾處介紹了一些為轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域帶來改變的新技術(shù)，特別是單細(xì)胞RNA-seq和長讀取測(cè)序技術(shù)帶來的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

2015年年初，RNA-Seq的數(shù)據(jù)分析方法如雨后春筍般涌現(xiàn)。三月份，Nature集團(tuán)旗下刊物發(fā)表了三篇介紹RNA-Seq數(shù)據(jù)分析新方法的文章，一篇發(fā)表在《Nature Methods》上，另外兩篇發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。這三篇文章有一位共同的作者，那就是約翰霍普金斯大學(xué)計(jì)算生物學(xué)中心的Steven Salzberg，生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)領(lǐng)域的杰出科學(xué)家。Salzberg通過這些文章中分別介紹了三種新工具：HISAT、StringTie和Ballgown。這些工具可以取代之前開發(fā)的早期工具，為RNA-Seq提供了全新的數(shù)據(jù)分析方法，從原始數(shù)據(jù)讀取到差異表達(dá)分析。（更多詳細(xì)信息參見：三篇文章介紹RNA-Seq數(shù)據(jù)分析的新工具）

RNA測(cè)序究竟有多可靠呢？由美國FDA牽頭的測(cè)序質(zhì)量控制（SEQC）項(xiàng)目對(duì)RNA測(cè)序的準(zhǔn)確性、可重現(xiàn)性和信息含量進(jìn)行了綜合性評(píng)估。其初步調(diào)查結(jié)果發(fā)表在2014年09月的Nature Biotechnology雜志上，石樂明教授是這篇文章的通訊作者之一。研究人員用RNA參照樣本在全球多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的Illumina HiSeq、Life Technologies SOLiD、Roche 454平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，主要評(píng)估RNA測(cè)序在接頭區(qū)域和差異性表達(dá)譜中的表現(xiàn)，并將其與芯片和定量PCR（qPCR）進(jìn)行比較。研究表明，數(shù)據(jù)分析的算法會(huì)對(duì)RNA測(cè)序產(chǎn)生很大影響，不同算法生成的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)存在很大差異。（更多詳細(xì)信息參見：石樂明教授Nature子刊：RNA測(cè)序到底可不可靠）

前幾天，浙江大學(xué)和哈佛大學(xué)的研究人員在Cell Reports雜志上發(fā)表了一項(xiàng)單細(xì)胞mRNA-seq研究。基因表達(dá)變異是小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）的一個(gè)重要特征，但人們一直不清楚這背后的具體原因。研究人員通過分析小鼠胚胎干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞表現(xiàn)出的異質(zhì)性是血清培養(yǎng)造成的。他們?cè)谄渲需b定了高度變異的基因簇，以及獨(dú)特的染色質(zhì)狀態(tài)。研究顯示，雙價(jià)基因（bivalent gene）更容易出現(xiàn)表達(dá)變異。進(jìn)一步研究表明，無血清培養(yǎng)可以減少小鼠ESC的異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄組變異。這意味著，細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)變異大多是細(xì)胞外的培養(yǎng)環(huán)境造成的。（更多詳細(xì)信息參見：浙大80后教授發(fā)表單細(xì)胞RNA測(cè)序研究）

生物通編輯：葉予

生物通推薦原文：A survey of best practices for RNA-seq data analysis