生物通報道   來自哈佛醫學院的研究人員開發出了一種預測軟件，可以準確找出最有效的方法利用CRISPR-Cas9基因編輯技術來實現基因打靶。這項重要的研究成果發布在《自然方法》（Nature methods）雜志上。

領導這一研究小組的是哈佛醫學院著名遺傳學教授、Wyss研究所的核心成員George Church。他被譽為是個人基因組學和合成生物學的先鋒。1984年，Church和WalterGilbert發表了首個直接基因組測序方法，該文章中的一些策略現在仍應用在二代測序技術中。此外，如今的多重化分子技術和條碼式標簽也是他發明的。Church還是納米孔測序技術的發明者之一。

利用CRISPR-Cas9系統科學家們可以非常容易及準確地改變基因組，這為通過遺傳工程來改善人類健康及環境帶來了新希望。Cas9是一種存在于某些細菌中的天然蛋白，它可以像一對分子剪刀一樣精確地切割DNA片段，是一種極其有效的基因編輯工具。借助于一段匹配的向導RNA（guide RNA）序列可以將Cas9引導至特異的基因處誘導基因突變，使得科學家們可以編程控制基因編輯。

盡管Cas9可以精確地完成這些功能，然而可能會有不止一條向導RNA可以與指定的靶基因匹配，因而研究人員一開始便面對著一項排查工作：為指定的基因編輯任務選擇出最佳的向導RNA。

為了繞過這一選擇向導RNA的試錯過程，研究小組開發出了一種簡單的新軟件程序，用來預測可將Cas9引導至靶基因處的最佳向導RNAs。

不同于科學家們當前使用的其他基因靶向算法，這一軟件是基于利用人類基因組收集的實驗數據分級排列任何給定向導RNA靶向目標靶基因的效率。

“這將普遍提高科學家們選擇出適當向導RNA的速度和準確性，從而達到他們期望的基因編輯結果，”Church說。

現在Church研究小組不僅公開了當前最常用的Cas9細菌源——化膿性鏈球菌（S. pyogenes ）的Cas9的有效向導RNAs信息，還提供了越來越普遍使用的另一種細菌物種——嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）最全面的向導RNA文庫（延伸閱讀：Nature發布CRISPR-Cas9重大新成果）。

為了開發出作為新軟件基礎的這一算法，Church研究小組高通量分析了許多靶基因和互補向導RNAs之間的活性，搜索了向導RNA序列的模式——這可以表明它們結合指定靶基因的效率。

為此，他們從每個靶基因中挑選出了一段獨特的序列，合成出一段完全相同的DNA來代表靶基因，隨后他們構建出了一個極大的DNA文庫，將它儲存在細胞質粒中。利用一種病毒作為傳送載體，他們隨后將這一文庫傳送到了培養細胞基因組中。為了測試出可以最有效抵達獨特靶基因處的向導RNAs，研究人員將互補的向導RNA與Cas9一起插入到細胞中，使得Cas9有機會在成功匹配的位點生成基因組突變。隨后的基因組提取及測序過程輕易地揭示出了與每個靶基因最佳匹配的向導RNA。

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基于這些數據，研究小組開發出了他們的新算法，并對靶向幾乎所有人類基因的最有效向導RNAs進行了排序和評分。

研究的主要作者、哈佛醫學院遺傳學研究人員Raj Chari說：“通過分析我們的結果，我們發現了向導RNA序列的一些特征，這些特征表明了它們可在多大程度上將Cas9引導至目標靶基因。通過基于這些特征設計出一種算法，我們現在可以檢測任何的向導RNA序列，打出分數來預計它的效率。”

通過加速基因編輯過程這部分的工作，科學家們可以將主要精力放到應用Cas9基因編輯，開發出一些基因療法來對抗諸如鐮狀細胞貧血、癌癥或艾滋病等疾病上，或是構建出遺傳工程生物幫助清理環境，或是執行其他的功能，例如持續地生成化學產品。

“對于所有在日常工作中使用RNA導向Cas9的科學家們而言，獲得這樣的一種工具將讓他們大大獲益，可迅速地縮小最有效引導Cas9到目的基因處去的向導RNA的范圍，”Chari說。

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

Unraveling CRISPR-Cas9 genome engineering parameters via a library-on-library approach

We developed an in vivo library-on-library methodology to simultaneously assess single guide RNA (sgRNA) activity across ~1,400 genomic loci. Assaying across multiple human cell types and end-processing enzymes as well as two Cas9 orthologs, we unraveled underlying nucleotide sequence and epigenetic parameters. Our results and software (http://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorer) enable improved design of reagents, shed light on mechanisms of genome targeting, and provide a generalizable framework to study nucleic acid–nucleic acid interactions and biochemistry in high throughput.