生物通報道  來自麻省總醫院的一個研究小組找到了一種新方法來擴大強大基因編輯工具——CRISPR-Cas9 RNA引導核酸酶的使用及提高其精確性。他們的研究論文在線發表在6月22日的《自然》（Nature）雜志上。

在這篇Nature文章中，研究人員描述了一種演化版本的DNA切割酶Cas9。相比于迄今為止使用的自然形式的Cas9，演化版本的Cas9能夠識別前者無法靶向的不同范圍的核酸序列。

論文的主要作者、麻省總醫院分子病理學部研究人員Benjamin Kleinstiver博士說：“在我們的論文中我們證實了采用我們設計改進的新的Cas9變體，現在可以靶向過去用野生型Cas9無法改造的人類和斑馬魚基因。這將使得研究人員能夠靶向各種基因組中擴大范圍內的一些位點，這對于需要高度精確靶向DNA序列的一些應用將會有用。”

CRISPR-Cas9核酸酶是由細菌Cas9酶和一段與DNA靶序列相匹配的、20個核苷酸的短RNA分子所構成。除了RNA/DNA匹配，Cas9酶還需要識別靶DNA附近、稱作為前間區序列鄰近基序（protospacer adjacent motif,PAM)的一段特異核苷酸序列。最常用的Cas9來自于釀膿鏈球菌，被稱作為SpCas9。SpCas9可以識別任何核苷酸后面有兩個鳥嘌呤DNA堿基的PAM序列。這將SpCas9靶向的PAM序列局限為必須包含兩個連續鳥嘌呤的DNA序列。

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為了解決這一限制，麻省總醫院研究小組建立了一個工程系統，使得他們能夠快速地演化SpCas9識別不同PAM序列的能力。通過收集隨機突變的SpCas9變體，他們鑒別出了使得SpCas9能夠新PAM序列的突變組合。這些演化變體基本上讓SpCas9可以進行靶向基因編輯的位點范圍擴大了一倍。

他們還意外地發現了一種更少可能誘導出脫靶基因突變的SpCas9變體。新論文的資深作者、麻省總醫院病理科副主任J. Keith Joung曾在其領導的2013年的一項研究中描述了CRISPR-Cas9核酸酶有時會生成脫靶基因突變這一問題。“應將這一特異性增高的改良SpCas9變體立即提供給當前采用野生型SpCas9的研究人員，這應該會減少不必要脫靶突變的頻率，”Joung說。

Joung補充道：“或許更為重要的是，我們的研究發現第一次證實了可以通過定向的蛋白質演化來改變SpCas9的活性。事實上，我們在論文中證實了存在于另外兩種細菌——金黃色葡萄球菌和嗜熱鏈球菌中的Cas9形式也可以在我們的細菌演化系統中發揮功能，表明我們應該也能夠改變它們的功能（延伸閱讀：張鋒Nature重大突破：用新型高效Cas9實現基因組編輯 ）。對于Cas9可靶向的PAMs的范圍，這項研究工作還只是了解了皮毛，我們相信通過相似的方法還可以改變Cas9酶其他的有用特性，使得有可能定制化許多重要的特性。”

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities

Although CRISPR-Cas9 nucleases are widely used for genome editing1, 2, the range of sequences that Cas9 can recognize is constrained by the need for a specific protospacer adjacent motif (PAM)3, 4, 5, 6. As a result, it can often be difficult to target double-stranded breaks (DSBs) with the precision that is necessary for various genome-editing applications. The ability to engineer Cas9 derivatives with purposefully altered PAM specificities would address this limitation. Here we show that the commonly used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) can be modified to recognize alternative PAM sequences using structural information, bacterial selection-based directed evolution, and combinatorial design. These altered PAM specificity variants enable robust editing of endogenous gene sites in zebrafish and human cells not currently targetable by wild-type SpCas9,