生物通報道：律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合，原本是細菌抵御病毒的重要武器，現(xiàn)在這一組合已經(jīng)成為了一個通用工具，被用于在真核生物中進行位點特異性的基因組編輯。

由于這種基因組編輯技術(shù)更易于操作，也具有更強的擴展性，CRISPRs-Cas9迅速成為了科研領(lǐng)域的新寵兒。

此前，麻省理工Broad研究所的張鋒（Feng Zhang，音譯）領(lǐng)導(dǎo)研究團隊，構(gòu)建了一個全基因組范圍內(nèi)的CRISPR敲除文庫（GeCKO），并在黑色素瘤模型中鑒定了對維羅非尼（Vemurafenib）產(chǎn)生抵抗的突變。這項研究表明，除了RNAi以外，人們也可以利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在人和小鼠細胞中進行功能缺失性篩選。

然而，之前用于CRISPR篩選的慢病毒遞送系統(tǒng)病毒滴度較低，還需要一個已經(jīng)表達Cas9的細胞系。這無疑限制了這一技術(shù)的應(yīng)用范圍。

為此，Feng Zhang等人對整個體系進行了改進，并在七月三十日的Nature Methods雜志上展示了升級版的CRISPR敲除文庫。Feng Zhang是麻省理工學(xué)院腦與認(rèn)知科學(xué)助理教授、McGovern 腦研究所和Broad研究所核心成員。去年七月，Feng Zhang榮獲了美國生物醫(yī)學(xué)大獎：瓦利基金青年研究家獎（Vallee Foundation Young Investigator Award），獎金25萬美元。其研究組研究方向為設(shè)計新的分子工具來操控活體大腦。

為了改進病毒包裝和引導(dǎo)序列，研究人員構(gòu)建了一個能生成高滴度病毒的新載體（lentiCRISPRv2）。研究顯示，新載體的功能性病毒滴度比lentiCRISPRv1差不多提高了十倍。

他們?yōu)榱诉M一步提高病毒滴度，還開發(fā)了一個雙載體系統(tǒng)，通過不同的病毒載體分別遞送Cas9 (lentiCas9-Blast)和sgRNA (lentiGuide-Puro)。其中，lentiGuide-Puro的功能性病毒滴度比之前的lentiCRISPRv1高了將近一百倍。研究人員發(fā)現(xiàn)，升級后的單載體和雙載體系統(tǒng)都能有效介導(dǎo)基因敲除。不過雙載體系統(tǒng)可以生成表達Cas9的細胞系，而單載體lentiCRISPRv2可能更適合活體應(yīng)用或者原代細胞篩選。

此外，研究人員還設(shè)計并合成了新的人、小鼠GeCKOv2 sgRNA文庫，進一步減少了脫靶效應(yīng)，并且新增了約一千個原始GeCKO文庫里沒有的目標(biāo)基因。（延伸閱讀：Nature子刊：黃行許教授解決基因組編輯的脫靶問題）

這項研究中的小鼠、人文庫都分為兩個亞文庫，每個亞文庫有三個sgRNA與目標(biāo)基因?qū)��?yīng)，還有一千個不靶向基因的對照sgRNA。研究者們可以選擇將兩個亞文庫結(jié)合起來進行篩選，這樣每個基因就對應(yīng)六個sgRNA。在細胞數(shù)有限的情況下（例如使用原代細胞或活體篩選）也可以只采用一個亞文庫。這些升級版的慢病毒載體和文庫，進一步拓展了CRISPR篩選的應(yīng)用范圍。

生物通編輯：葉予

生物通推薦原文：

Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening