生物通報(bào)道：基因組編輯是生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)常用策略，可以引入新突變來(lái)進(jìn)行功能研究，也可以對(duì)致病突變進(jìn)行修復(fù)�，F(xiàn)在人們手頭的編輯技術(shù)主要有三種，鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN以及CRISPR/Cas。

這三種方法都要用到特異性核酸酶，在DNA上的指定位點(diǎn)引入雙鏈斷裂。細(xì)胞主要通過(guò)兩種途徑來(lái)修復(fù)這樣的損傷，非同源性末端接合（NHEJ）和同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）。其種，同源重組修復(fù)能夠按照根據(jù)研究者的指令改寫(xiě)DNA序列。目前，基因組編輯已經(jīng)廣泛用于基因敲除、探索疾病病因、開(kāi)發(fā)新藥物、以及基因治療。

從根本上來(lái)看，上述基因組編輯技術(shù)都能完成任務(wù)。不過(guò)CRISPR/Cas誕生之后，風(fēng)頭很快就蓋過(guò)了ZFN和TALEN。這是因?yàn)椋?/SPAN>CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅操作簡(jiǎn)便，還有著很大的多重化潛力。

近來(lái)，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于各種生物（從瘧蚊到斑馬魚(yú)），催生了大量的研究成果。各大商家也沒(méi)有錯(cuò)失良機(jī)，它們開(kāi)發(fā)出了大量的試劑和工具，幫助研究者們開(kāi)展自己的CRISPR/Cas研究。

琳瑯滿目的分子工具

ZFN和TALEN需要進(jìn)行克隆、基因工程和優(yōu)化，而CRISPR/Cas只需要向細(xì)胞引入Cas9核酸酶和20個(gè)核苷酸的single-guide RNA（sgRNA，引導(dǎo)RNA）。引導(dǎo)RNA負(fù)責(zé)將核酸酶帶到正確的位點(diǎn)進(jìn)行切割。

許多公司都提供有預(yù)設(shè)計(jì)的工具來(lái)表達(dá)CRISPR/Cas元件。舉例來(lái)說(shuō)，Sigma-Aldrich公司就提供了針對(duì)人、小鼠、大鼠所有基因的Cas9 和sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，用戶(hù)只需要在網(wǎng)上進(jìn)行簡(jiǎn)單的選購(gòu)。當(dāng)然，你也可以根據(jù)自己的特殊需求進(jìn)行定制。

“至少?gòu)谋砻嫔峡矗?/SPAN>CRISPR基因組編輯實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)起來(lái)要比ZFN直觀得多，因?yàn)樗�涉及的�?/SPAN>RNA-DNA相互作用，”Sigma公司的Shawn Shafer說(shuō)。。（延伸閱讀：Nature子刊：黃行許教授解決基因組編輯的脫靶問(wèn)題）

Sigma-Aldrich公司制備有純化的sgRNA文庫(kù)，這種即用型產(chǎn)品可以用來(lái)直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可以與純化的Cas9核酸酶一起使用。特別適合那些想建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型或擔(dān)心質(zhì)粒整合的研究人員。

此外，Sigma公司還提供有配對(duì)的切口酶（nickase）設(shè)計(jì)，該產(chǎn)品含有表達(dá)引導(dǎo)RNA的兩個(gè)質(zhì)粒，Cas9-D10A切口酶需要單獨(dú)訂購(gòu)。這種切口酶是Cas9的突變蛋白，只切割一條DNA鏈，能夠明顯減少脫靶效應(yīng)，同時(shí)保持高效的基因修飾。

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Thermo Fisher公司也有一系列支持CRISPR/Cas應(yīng)用的產(chǎn)品。GeneArt® CRISPR核酸酶載體有兩個(gè)報(bào)告基團(tuán)可選：橙色熒光蛋白（OFP）用于流式細(xì)胞分選，CD4用于磁珠富集。該產(chǎn)品能夠有效選擇和富集表達(dá)Cas9和CRISPR RNA的細(xì)胞。此外，Thermo Fisher公司還提供有表達(dá)Cas9的mRNA，既可以搭配RNA形式的sgRNA，也可以搭配相應(yīng)的CRISPR Strings™載體（用U6啟動(dòng)子在細(xì)胞中表達(dá)sgRNA的DNA載體）。

據(jù)Thermo公司的Helge Bastian介紹，CRISPR Strings™載體旨在讓新手更容易進(jìn)行基因組編輯。如果以RNA的形式引入核酸酶和sgRNA，“操作者就需要進(jìn)行RNA處理的培訓(xùn)，還要小心避免富含RNase的環(huán)境，以免最重要的分子被降解�！笔褂�DNA載體的話，操作起來(lái)就要簡(jiǎn)單得多。

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rAAV和純化的Cas

Horizon Discovery公司也提供有一系列CRISPR/Cas工具，比如組成型表達(dá)Cas9核酸酶的QuickStart細(xì)胞系，只需要添加相應(yīng)的sgRNA，就能夠進(jìn)行基因組編輯。

該公司還開(kāi)發(fā)了可用于基因組編輯的腺相關(guān)病毒載體（rAAV）。該公司的Eric Rhodes介紹說(shuō)，rAAV作為單鏈DNA比傳統(tǒng)質(zhì)粒更容易進(jìn)入細(xì)胞核，可以提供更有效的基因組編輯，只不過(guò)這種載體有片段大小的限制（大約5 kb）。

NEB公司推出的CRISPR新產(chǎn)品是純化的Cas9核酸酶。該公司的Brett Robb指出，不通過(guò)表達(dá)載體或mRNA，直接將Cas9蛋白送進(jìn)細(xì)胞，可以更精確的控制Cas9的使用劑量。目前已經(jīng)有一些研究展現(xiàn)了這一策略的有效性。

韓國(guó)研究者構(gòu)建了Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體，并將其引入了體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)，這一策略的位點(diǎn)特異性突變頻率高達(dá)79%，而且減少了與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有關(guān)的脫靶突變。哈佛大學(xué)Alex Schier領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)，則通過(guò)顯微注射將Cas9-sgRNA RNP引入斑馬魚(yú)胚胎。與Cas9 mRNA和sgRNA的組合相比，Cas9-sgRNA RNP的突變生成率更高。

如何評(píng)估編輯的效率和準(zhǔn)確性

為了評(píng)估基因組編輯的效率，Thermo Fisher公司推出了GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit。該試劑盒的方案是，首先對(duì)編輯目標(biāo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性和退火。已編輯和未編輯的擴(kuò)增子存在序列差異，會(huì)在退火階段形成不匹配的單鏈區(qū)域，而試劑盒里的酶可以切割這些區(qū)域。

另外，我們也可以通過(guò)基因組測(cè)序，來(lái)檢測(cè)基因組編輯之后細(xì)胞中發(fā)生的改變。今年早些時(shí)候，Ayal Hendel及其同事使用PacBio RS深度測(cè)序，評(píng)估了ZFN、TALEN和CRISPR/Cas的基因組編輯結(jié)果。

PacBio公司SMRT測(cè)序技術(shù)能帶來(lái)15 kb的讀長(zhǎng)，正是這一特點(diǎn)讓PacBio特別適合于基因組編輯的評(píng)估工作，Pacific Biosciences公司的Jonas Korlach說(shuō)。在基因組編輯技術(shù)中，人們廣泛使用有著長(zhǎng)長(zhǎng)一段同源臂的供體模板，以提高原代細(xì)胞的HDR效率。而這些供體模板對(duì)于Illumina等短讀取系統(tǒng)來(lái)說(shuō)太長(zhǎng)了。

研究人員指出，不論是NHEJ編輯 還是HDR 編輯，CRISPR/Cas都比TALEN更加有效。更重要的是，他們還向人們展現(xiàn)了一種稱(chēng)為“mini-translocations”的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象是指，編輯位點(diǎn)拷貝了錯(cuò)誤的供體序列，比如表達(dá)核酸酶的質(zhì)粒DNA，或者是其它細(xì)胞染色體DNA。研究人員甚至觀察到了，來(lái)自TALEN表達(dá)載體的289個(gè)核苷酸插入。

據(jù)介紹，Hendel等人正在著手優(yōu)化HDR編輯的效率，他們希望能夠把這種技術(shù)應(yīng)用到遺傳性血液病的治療中。目前HDR編輯造血干細(xì)胞的效率是3% 到5%，“我們正在想辦法提高效率，希望能盡快用這一技術(shù)進(jìn)行基因治療。”

CRISPR來(lái)了，你還在等什么呢？有這么多工具在手，你需要做的只是確定一個(gè)引導(dǎo)RNA。Addgene、Sigma-Aldrich等機(jī)構(gòu)都提供有預(yù)設(shè)計(jì)的sgRNA文庫(kù)。不過(guò)，如果你想要自己動(dòng)手設(shè)計(jì)，這兩個(gè)網(wǎng)站應(yīng)該可以幫到你：CHOPCHOP，以及張鋒博士的CRISPR Design。

參考文獻(xiàn)：

 [1] Kim, S, et al., “Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins,” Genome Res, 24:1012-9, 2014. [PubMed ID: 24696461]

[2] Gagnon, JA, et al., “Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs,” PLoS ONE, 9:e98186, 2014. [PubMed ID: 24873830]

[3] Hendel, A, et al., “Quantifying genome-editing outcomes at endogenous loci with SMRT sequencing,” Cell Reports, 7:293-305, 2014. [PubMed ID: 24685129]

Correction (Aug. 22): The original version of this document referred to the GeneArt portfolio as a product of Life Technologies. Life Technologies has been acquired by Thermo Fisher Scientific. The article has been updated to reflect that change.