Western blot常用于確定生物樣本中蛋白質(zhì)的相對表達量。傳統(tǒng)的化學發(fā)光法是一種定性或半定量的方法，因為累積發(fā)光量缺少線性和定量的重復性。隨著熒光染料技術(shù)的進步，定量范圍、靈敏度和穩(wěn)定性都較ECL檢測顯著提高，Western blot檢測也因此進入了定量分析的行列，而這對樣品上樣量一致性的控制提出了更高的要求。LI-COR公司是定量Western blot領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊，它的Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)具有*高的市場占有率，核心的近紅外熒光染料具有定量準確、線性范圍廣、背景低、信噪比高以及雙色檢測等優(yōu)勢，作者利用這一系統(tǒng)開展了如下的研究。

為了精確測定樣品中蛋白質(zhì)的含量，研究者常設(shè)置loading controls （LCs）用作內(nèi)參。常用的LCs蛋白源于廣泛表達的“看家基因”，因為他們被認為在一系列樣品中都有一致的表達水平，其中肌動蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）是*常用的兩種LCs。但是，越來越多的研究指出這些蛋白質(zhì)在動物和實驗模型中差異表達。此外，LCs在不同組織間或不同處理間也存在差異。因此急需新的標準化方法確保定量Western blot結(jié)果的準確性。

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作者首先檢索了已發(fā)表的芯片數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)常用的細胞骨架蛋白（actin，actinin和各種tubulin異構(gòu)體）、線粒體蛋白（VDAC1和VDAC2）和細胞核蛋白（HC1）都存在差異表達。

接著作者用Odyssey的定量Western blot檢測了脊髓性肌萎縮（Spinal muscular atrophy，SMA）小鼠的脊髓組織樣本和正常樣本中β肌動蛋白和β微管蛋白的表達水平。結(jié)果見圖1，這兩個蛋白的表達量在SMA小鼠中顯著下降，分別為19.3±2%和7.3±0.5%。而這兩個樣本在總蛋白上的一致性卻非常好，差異只有1.8±0.4%。

圖1：β-肌動蛋白和β-微管蛋白的定量Western blot結(jié)果表明其在病理組織中的表達改變。A：β-肌動蛋白（42 kDa，綠色）和總蛋白（紅色）的重疊圖；B：β-微管蛋白（60 kDa，綠色）和總蛋白（紅色）的重疊圖；C：SMA小鼠和正常小鼠β-肌動蛋白和β-微管蛋白表達水平的變化，β-肌動蛋白（黑色），β-微管蛋白（灰色）。總蛋白（白色）用作對照。

證實了LCs在病變組織和正常組織間存在差異表達后，作者研究了LCs在不同正常組織間的差異表達。作者用Odyssey定量Western blot檢測了C57Bl/6小鼠的肌肉、心臟、骨骼、顱骨，脾和脂肪組織中β-肌動蛋白的表達水平（圖2 A和B）。為了確認這種變異不是由于上樣量誤差所引發(fā)，作者檢測了不同分子量范圍內(nèi)的總蛋白（圖2C）。結(jié)果表明這種差異非常小，上樣的一致性非常好。不同組織間β-肌動蛋白的表達水平呈現(xiàn)出顯著的差異（圖2 B和D），尤其是心臟和腎臟間的差異尤為顯著，達到44 arbitrary fluorescence units (AFU)。顯然，用β-肌動蛋白去做數(shù)據(jù)均一化以及不同組織間的比較會導致巨大的偏差。

圖2：β-肌動蛋白的表達水平在不同組織間高度變化。A：組織樣本示意圖，從左至右依次為：肌肉（腓腸肌），心臟，骨（股骨），顱骨，脾和脂肪組織（性腺）。比例尺=1厘米。B：Odyssey定量Western blot結(jié)果展示β-肌動蛋白（綠色）的表達水平在肌肉，心臟，骨骼，顱骨，脾和脂肪中高度變異。總蛋白染色（紅色）疊加作為對照。C：不同分子量范圍內(nèi)的總蛋白量表明上樣量控制的準確性。D.堆積條形圖顯示出β-肌動蛋白的相對變化（綠色）和總蛋白測定（紅色）。

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另外，作者還發(fā)現(xiàn)在非對稱組織的不同部位，LCs的表達水平也是不一致的。作者采用Odyssey定量Western blot研究了小鼠坐骨神經(jīng)近端和遠端β-肌動蛋白與neurofilament-light的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白質(zhì)在不同區(qū)域的表達水平不一致（圖3）。同樣地，作者發(fā)現(xiàn)總蛋白具有很好的一致性。

圖3：肌動蛋白和NF-L在小鼠坐骨神經(jīng)的不同區(qū)域表達水平不同。

理想的內(nèi)參需要具有寬的線性定量范圍以滿足不同豐度蛋白的定量需要。為了評估β-肌動蛋白和β-微管蛋白在定量Western blot上的適用性，作者檢測了它們的工作線性范圍和靈敏度。檢測樣本為梯度稀釋的小鼠大腦組織勻漿液，總蛋白量為1-40 μg。結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-肌動蛋白的線性范圍為1-30 μg總蛋白量（圖4 A和B）。這一定量Western blot的檢測結(jié)果與先前報道的結(jié)果有差異，先前認為2 μg的總蛋白量β-肌動蛋白的信號就會達到飽和。這一差異在于先前研究采用的是低靈敏度的ECL檢測，這一方法的定量能力不及Odyssey的近紅外熒光檢測技術(shù)。β-微管蛋白的的情況類似，只是其在大腦中的豐度更高，因此總蛋白量在8-10 μg時它的信號就達到了飽和（圖4 A和B）。這一結(jié)果同樣與先前的報道不一致，先前認為β-微管蛋白線性范圍的上限為5 μg的總蛋白量。這一差異同樣也是方法學上的差異所引起的。根據(jù)上述結(jié)果，β-微管蛋白更適于在檢測低豐度蛋白時用作內(nèi)參，而β-肌動蛋白具有更寬的線性范圍。另外，相比傳統(tǒng)的ECL法，LICOR公司的近紅外熒光染料顯然可以提供更加寬廣的線性范圍。

*后，作者提出了用總蛋白分析（total protein analysis）進行準確可靠的上樣控制。作者用梯度稀釋的胎牛血清白蛋白（BSA）標準品評估檢測的靈敏度（圖4 E和F）。熒光信號的線性非常好，R2達到0.998。另外，從圖像可以看出，Odyssey近紅外熒光法可以減少ECL法中常見的信號飽和問題。在實際應用中，總蛋白分析（考馬斯亮藍染色）具有比肌動蛋白和微管蛋白更寬的線性范圍，1-40 μg，圖4G和H。因此，以總蛋白分析做標準化能夠很好地滿足定量Western blot的需求。

圖4：總蛋白分析具有比傳統(tǒng)內(nèi)參蛋白（肌動蛋白和微管蛋白）更好的靈敏度和更寬的線性范圍。

原文：Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting

欲了解近紅外技術(shù)的其他應用，請參見“基于近紅外熒光檢測技術(shù)的In-Cell Western™ Assay的應用與方法學優(yōu)勢” http://m.beijingyunkai.cn/newsf/2012-10/2012101094727739.htm

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