Western Blot是對蛋白質進行分析的*常用的技術之一，在RNAi篩選和藥物篩選磷酸化分析中往往涉及到高通量的Western Blot操作。這樣的實驗通常是對2種以上的蛋白質進行檢測（內參蛋白與目的蛋白，總蛋白與磷酸化蛋白），化學發光法需要Strip，且定量不準確，膜上操作步驟繁瑣，涉及到細胞裂解、電泳、轉膜等諸多環節。In-Cell Western™ Assay則直接將微孔板內的細胞經過甲醛固定、透化、孵育一抗二抗并洗滌等簡單步驟，*后直接將微孔板掃描成像。In-Cell Western的相對靈敏度同于或好于膜上的Western，由于省去了多個手動步驟而減少了實驗誤差，使得Intra-Assay和Inter-Assay的重復性都大為提升。

一、In-Cell Western原理、實驗流程示意圖

    用微孔板培養細胞后直接將板內的細胞用甲醛固定、透化后孵育一抗二抗，洗滌后直接將微孔板掃描成像。

二、In-Cell Western相對膜上Western的操作步驟大為簡化

    In-Cell Western用紅外標記的二抗直接標記細胞內的蛋白，可定量每個微孔內的總熒光量。在In-Cell Western分析中，省略了細胞裂解物的制備，制膠，電泳以及轉膜等這些費時又易于產生錯誤的步驟，避免了細胞裂解過程的不穩定性和人工產物的干擾，并且可同時進行多個樣品的檢測。雙色檢測使定量更為精確，同時由于一般的酶檢測方法針對的是純化過的蛋白，因而這種細胞內的檢測結果能提供更多更準確的信息量。

三、為什么選擇雙色近紅外熒光技術？

    相對于化學發光法，熒光信號的線性范圍更加寬廣，定量準確，而一般的熒光染料不能直接用于檢測膜上的蛋白或者塑料培養皿中的蛋白，因為它們的激發和檢測波長位于可見光譜區，從而容易產生高背景熒光干擾。近紅外熒光（670-1100 nm）染料在長波下它的背景熒光很低，具有很好的信噪比。Odyssey紅外激光檢測系統利用這一原理，系統同時發出兩種紅外波長的激光進行檢測，其內部含有兩個激光二極管，分別產生兩種波長的激光（680nm和780nm），另外還有兩個激光檢測器，分別檢測720nm和820nm波長的熒光信號，該系統可以用于檢測膜上和微孔板上的蛋白或核酸。在此基礎上，雙色熒光則可同時檢測2種以上的靶蛋白，尤其適用于磷酸化分析。除此之外，用紅外染料標記的抗體，在不同的波長下可一次同時檢測膜或微孔板上的多種蛋白分子，并由于熒光信號強度和蛋白的豐度或含量具有很好的線形相關性，它不同于化學發光法是一種基于酶促反應，其檢測易受到諸多因素影響而導致定量不準確，因此可以進行準確的定量。這是化學發光法和同位素技術所無法完成的。

四、雙色In-Cell Western分析

 
    將A431細胞接種于96孔板上培養，細胞用100 ng/ml的EGF處理15分鐘。處理完畢后，將細胞用4%的甲醛/PBS室溫固定20分鐘，再用0.1% Triton X-100/PBS洗滌3次。兔抗和鼠抗分別作用于總ERK和磷酸化的EKR，羊抗兔抗體用Alexa Fluor® 680標記，羊抗鼠抗體用IRDye 800標記，因而總ERK（紅色）和磷酸化的ERK（綠色）被直觀的顯示出來。以總蛋白作為內參，對ERK蛋白的磷酸化進行定量分析。

五、小結

    In-Cell Western相對于膜上Western而言，省去了細胞裂解、電泳、轉膜等繁瑣步驟，降低了引入實驗誤差的風險，故而其Intra-Assay和Inter-Assay的重復性均好于膜上的Western，如此提高了實驗數據的可比性和可信度，是高通量分析蛋白表達時的理想方法。

In-Cell Western檢測平臺：LI-COR Odyssey® System  索取更多資料

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