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核酸檢測的一場革命，可替代PCR的犀利技術

【字體：大中小】 時間：2014年10月30日 來源：生物通

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　　重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司TwistDx Inc開發(fā)）。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領域。

生物通報道：自PCR技術誕生以來已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。

重組酶聚合酶擴增RPA（Recombinase Polymerase Amplification），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。英國公司TwistDx Inc以此為基礎開發(fā)的TwistAmp® 核酸擴增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領域。

RPA技術犀利在何處

常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的最適溫度在37°C - 42°C之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。

據(jù)介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約10¹²擴增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。（延伸閱讀：新型移動HIV-DNA檢測技術）

RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產(chǎn)物進行終點檢測，還可以對擴增過程進行實時監(jiān)控，甚至可以通過試紙條（側流層析試紙條LFD）讀取結果。

目前，TwistAmp®試劑盒的擴增子長度在500bp以內。不過，經(jīng)過特別優(yōu)化的RPA擴增，也可以生成更長的擴增產(chǎn)物，或者減慢擴增速度（便于定量），甚至在更低的溫度下進行反應。（詳見TwistDx Inc公司官網(wǎng)：www.twistdx.co.uk）

RPA技術的基本原理

RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37°C左右。

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。

相當靈活的檢測模式

RPA擴增的基礎體系（TwistAmp® Basic）含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要準備好引物和模板就行。擴增結果可以通過凝膠電泳進行終點檢測，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。

在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，就可以實現(xiàn)多樣化的RPA應用。舉例來說，在基礎體系里添加逆轉錄酶（TwistAmp® Basic RT），可以對RNA模板進行一步法擴增。

將RPA基礎體系、專利的exo探針技術和核酸外切酶III結合起來（TwistAmp® exo），能實現(xiàn)數(shù)據(jù)的實時讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應終點的擴增子總量有所減少，適合獲得強熒光信號進行動力學分析，不適合終點檢測（比如跑膠）。在TwistAmp® exo的基礎上加入逆轉錄酶（TwistAmp® exo RT），就可以一步實現(xiàn)RNA模板的實時擴增。