案例一：lncRNA lnc-DC控制人類樹突狀細(xì)胞分化

lncRNA作用類型：作為配體保護(hù)轉(zhuǎn)錄因子STAT3磷酸化位點

研究者利用外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞這一模型，通過轉(zhuǎn)錄組芯片及RNA-Seq，首先鑒別出一個在人DC中特異表達(dá)的lncRNA，并將其命名為lnc-DC。后利用ChIP-Seq確認(rèn)lnc-DC基因轉(zhuǎn)錄起始位點處H3K4me3組蛋白修飾水平上升，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PU.1親和力增加，確定DC分化過程中l(wèi)nc-DC上調(diào)原因。
其后，研究者使用慢病毒載體沉默DC中的lnc-DC，使用轉(zhuǎn)錄組芯片及流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)DC功能基因下調(diào)，多種T細(xì)胞激活關(guān)鍵蛋白下調(diào)，單核細(xì)胞標(biāo)記上調(diào)。說明lnc-DC的缺失會改變DC分化趨勢，影響DC功能。

通過RNA FISH確認(rèn)lnc-DC定位于核內(nèi)，RIP-Seq發(fā)現(xiàn)lnc-DC不會與AGO2和ALU元件結(jié)合。研究者使用生物素化lnc-DC，通過RNA pull down及MS分析，確認(rèn)lnc-DC與轉(zhuǎn)錄因子STAT3互作。使用lnc-DC突變體及攜帶不同標(biāo)記的STAT3分別進(jìn)行RIP實驗，確認(rèn)lnc-DC與STAT3結(jié)合模式。最后通過免疫印跡、核內(nèi)外免疫熒光檢測及磷酸化分析，發(fā)現(xiàn)lnc-DC會阻止磷酸酶SHP1與STAT3的結(jié)合，保護(hù)Y705磷酸化狀態(tài)，增強(qiáng)DC中的STAT3信號通路，以此實現(xiàn)其維持與促進(jìn)人DC發(fā)育成熟和激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，最終對DC分化發(fā)育、抗原遞呈與免疫激活功能起到至關(guān)重要的作用。

lnc-DC基因ChIP-Seq （上面三行）多位點ChIP-qPCR（中間兩行）結(jié)果

lnc-DC/STAT3免疫印跡和RIP結(jié)果

 
lncRNA芯片數(shù)據(jù)

 
lnc-DC在人DC分化過程中作用模式圖

相關(guān)文獻(xiàn)：Wang P, Xue Y, Han Y, et al. The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation[J]. Science, 2014, 344(6181): 310-313.

案例二：lncRNA- PACER激活致癌基因COX-2表達(dá)

作用類型：轉(zhuǎn)錄調(diào)控/表觀遺傳調(diào)控

研究者懷疑致癌基因COX-2的轉(zhuǎn)錄控制與ncRNA有關(guān)，使用人乳腺表皮細(xì)胞（HMEC）進(jìn)行ChIP實驗，在COX-2轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游-0.3kb處，發(fā)現(xiàn)一個額外啟動子，且這個啟動子和COX-2啟動子內(nèi)有兩個CTCF/cohesin二聚體的結(jié)合位點。沉默CTCF/cohesin，ChIP分析COX-2啟動子及上游區(qū)域內(nèi)染色質(zhì)修飾水平，發(fā)現(xiàn)這兩個二聚體所隔離出的染色質(zhì)區(qū)域轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了一段lncRNA，研究者將此lncRNA命名為p50-Associated COX-2 Extragenic RNA，PACER）。對沉默PACER后的HMEC進(jìn)行ChIP-qPCR實驗，證實PACER可富集組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶p300，促進(jìn)染色質(zhì)乙�；�化，影響RNA pol II復(fù)合物形成（RNAP II）。不過，RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)PACER并非直接與p300互作，RIP及RNA蛋白互作實驗證明NF-κB家族蛋白p50會與PACER結(jié)合，PACER則會促進(jìn)結(jié)合在基因啟動子上的基因抑制復(fù)合物p50/p50二聚體轉(zhuǎn)化成p50/p65二聚體，實現(xiàn)富集p300的作用。

ChIP-Seq發(fā)現(xiàn)Cox-2 TSS上游有額外啟動子

ChIP確認(rèn)兩個啟動子區(qū)域內(nèi)有CTCF/cohesin結(jié)合位點

ChIP驗證CTCF沉默對不同組蛋白修飾的影響

RIP驗證p50同PACER互作

PACER作用通路示意圖

相關(guān)文獻(xiàn)：Krawczyk M, Emerson B M. p50-associated COX-2 extragenic RNA (PACER) activates COX-2 gene expression by occluding repressive NF-κB complexes[J]. eLife, 2014, 3.

案例三：lncRNA通過超保守區(qū)域影響Drosha剪切產(chǎn)生成熟miR-195

作用類型：轉(zhuǎn)錄后調(diào)控/miRNA調(diào)控

miR-195已經(jīng)證明與癌癥細(xì)胞增殖與耐藥性有關(guān)，在本項研究中，研究者希望進(jìn)一步了解miR-195的調(diào)控機(jī)制，他們利用miRNA芯片檢測HCT116細(xì)胞，通過分析差異miRNA種子序列，發(fā)現(xiàn)Uc.283+A這個lncRNA中的超保守區(qū)域（T-UCR）與pri-miR-195上Drosha剪切位點上游存在一段互補(bǔ)序列。EMSA實驗證明pri-miR-195確實會同Uc.283+A互作。使用qPCR檢測HCT116細(xì)胞和SK-N-BE(2)細(xì)胞中Uc.283+A與成熟miR-195表達(dá)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)二者負(fù)相關(guān)；對其他數(shù)個類型癌細(xì)胞進(jìn)行脫甲基化處理后發(fā)現(xiàn)，Uc.283+A、pri-miR-195和成熟miR-195中CpG島被脫甲基化后，Uc.283+A、pri-miR-195會上調(diào)，但miR-195卻會下調(diào)。使用野生型Uc.283+A與pri-miR-195進(jìn)行體外孵育實驗，Uc.283+A與成熟miRNA依然呈負(fù)相關(guān)，但如果使用pri-miR-195突變體或兩個RNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合阻礙物進(jìn)行孵育，成熟miR-195則不再受影響。

以上實驗充分證明，Uc.283+A是利用T-UCR中與pri-miR-195的互補(bǔ)序列，下調(diào)成熟miR-195。因為兩ncRNA互補(bǔ)區(qū)位于Drosha剪切位點上游，研究者假設(shè)這個過程是通過兩RNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合影響Drosha對pri-miR-195的剪切。為此，研究者使用RNA antisense purification（RAP）法，發(fā)現(xiàn)兩RNA之間的互補(bǔ)配對，會影響一個名為DGCR8的蛋白同pri-miR-195的結(jié)合，由于Drosha需要同DGCR8蛋白形成復(fù)合體才能對pri-miR-195進(jìn)行剪切，Uc.283+A對DGCR8的影響會直接阻礙Drosha-DGCR8復(fù)合體形成，最終影響成熟miR-195的豐度。

Uc.283+A控制Drosha對pri-miR-195剪切機(jī)制示意圖

 
RNA antisense purification（RAP）示意圖

相關(guān)文獻(xiàn)：Liz J, Portela A, Soler M, et al. Regulation of pri-miRNA Processing by a Long Noncoding RNA Transcribed from an Ultraconserved Region[J]. Molecular Cell, 2014.

案例四：HOTAIR改變?nèi)旧�質(zhì)狀態(tài)促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移

作用類型：表觀遺傳調(diào)控

通過超高密度tiling array及qPCR分析不同乳腺癌細(xì)胞（原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)移型乳腺癌細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)HOTAIR顯著上調(diào)。沉默HOTAIR，通過活體成像可以明顯發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移減弱。HOTAIR通常會與組蛋白H3K27甲基化酶復(fù)合體PRC2結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控作用，通過ChIP-on-chip，發(fā)現(xiàn)在HOTAIR上調(diào)時，有854個基因被PRC2所結(jié)合，出現(xiàn)H3K27me3組蛋白修飾，許多基因都是癌癥轉(zhuǎn)移的正向調(diào)節(jié)因子，也說明HOTAIR會通過與PRC2互作，改變?nèi)旧�質(zhì)狀態(tài)促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。

 
ChIP-on-chip結(jié)果

 
HOTAIR-PRC2互作，改變組蛋白修飾狀態(tài)，影響癌癥基因表達(dá)

相關(guān)文獻(xiàn)：Gupta R A, Shah N, Wang K C, et al. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J]. Nature, 2010, 464(7291): 1071-1076.

案例五：lncRNA拷貝數(shù)變異引發(fā)癌癥

作用類型：轉(zhuǎn)錄調(diào)控/突變

本項研究中，研究者將目光集中于lncRNA拷貝數(shù)變異同癌癥發(fā)生的關(guān)系上，他們分析了不同數(shù)據(jù)庫中癌癥樣本的SNP檢測結(jié)果，，篩選出188個出現(xiàn)SCNA的lncRNA，使用shRNA在數(shù)個癌細(xì)胞系中沉默這些lncRNA，發(fā)現(xiàn)在沉默F(xiàn)AL1基因（focally amplified lncRNA on chromosome 1）時在體內(nèi)和體外都會顯著減少癌細(xì)胞數(shù)目，將此lncRNA的cDNA導(dǎo)入卵巢表皮細(xì)胞，也會誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，且在對128個卵巢癌晚期病人癌細(xì)胞進(jìn)行檢測后，發(fā)現(xiàn)FAL1的獲得性SCNA與病人存活率降低有關(guān)。

為了探明FAL1獲得性SCNA的致癌機(jī)制，研究者首先檢測了更多癌細(xì)胞中FAL1 RNA轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AL1 RNA轉(zhuǎn)錄同獲得性SCNA為正向相關(guān)。使用RNA pull down、Western Bloting及RIP qPCR確認(rèn)FAL1 RNA的結(jié)合蛋白為BMI1。由于BMI1又是PRC1（polycomb repressive complex 1）復(fù)合體的一個亞基，F(xiàn)AL1對BMI1的穩(wěn)定又會進(jìn)一步提高PRC1的穩(wěn)定性。PRC1是一個染色體修飾復(fù)合物，會抑制很多基因表達(dá)。在癌細(xì)胞中用shRNA沉默F(xiàn)AL1或BMI1，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量上升最大的是CDKN1A基因，該基因與癌癥發(fā)生有關(guān)，而FAL1可能是通過調(diào)控BMI1在CDKN1A啟動子的結(jié)合效率來控制CDKN1A的轉(zhuǎn)錄，提高CDKN1A表達(dá)量。另外，沉默F(xiàn)AL1會明顯誘導(dǎo)癌細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期，增加細(xì)胞衰老速度，也進(jìn)一步顯示了FAL1的致癌作用。

 
RNA pull down流程及結(jié)果

 
 
RIP檢測過程與結(jié)果

相關(guān)文獻(xiàn)：Hu X, Feng Y, Zhang D, et al. A Functional Genomic Approach Identifies FAL1 as an Oncogenic Long Noncoding RNA that Associates with BMI1 and Represses p21 Expression in Cancer[J]. Cancer cell, 2014, 26(3): 344-357.

延伸閱讀：

《相約2015NSFC》之疾病相關(guān)lncRNA研究策略

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