1. 概述

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，通常認為它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）參與蛋白編碼基因調控。

大多數lncRNA的二級結構，剪切形式以及亞細胞定位都較為保守，這對lncRNA發揮功能非常重要。但相對于miRNA和蛋白質的功能來說，lncRNA功能機制更加難以確定，目前并不能僅根據序列或者結構來推測它們的功能。根據lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以將其分為sense、antisense、bidirectional、intronic、intergenic這5種類型。這種位置關系對于推測lncRNA的功能有很大幫助。

 
不同位置lncRNA示意圖

2. lncRNA生物學功能

在哺乳動物基因組中，有4%~9%的序列產生的轉錄本是lncRNA（相應的蛋白編碼RNA的比例是1%）。lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉錄的副產物，不具有生物學功能。然而，近年來的研究表明，lncRNA會廣泛參與到染色體沉默，基因組印記、染色質修飾，轉錄激活，轉錄干擾，核內運輸等多種重要的調控過程，通過對已發現的lncRNA的研究，研究者已發現lncRNA能夠在多種層面調控基因表達，一般來說，主要包括以下三個層次：

2.1. 表觀遺傳學調控
某些特異的lncRNA會招募染色質重構和修飾復合體到特定位點，改變DNA/RNA甲基化狀態、染色體結構和修飾狀態，進而控制相關基因的表達。很多DNA/RNA甲基化突變與癌癥等某些疾病發生有關，而染色質修飾狀態的改變也通常會影響到某些基因的表達狀態，最常見的是在啟動子區域出現的H3K4me3、H3K9me2及H3K27me3修飾等，這些組蛋白修飾會改變染色質活性，從而促進或抑制轉錄，控制基因表達。

這類lncRNA中，最典型的是HOXC基因簇轉錄的lncRNA HOTAIR，會募集染色質修飾復合體PRC2，并將其定位到HOXD基因簇位點，改變該區域的染色質修飾狀態，進而抑制HOXD基因表達。已經有臨床研究表明，在乳腺癌、結腸癌和肝癌等腫瘤組織中HOTAIR表達水平與腫瘤轉移、復發及預后效果緊密相關，腫瘤細胞中HOTAIR高表達會抑制某些腫瘤轉移抑制基因，促進腫瘤惡化，反之，沉默HOTAIR則會使腫瘤細胞喪失轉移能力。除了HOTAIR，還有其他一些lncRNA可以通過募集染色質修飾復合體，對DNA/RNA和組蛋白的表觀遺傳狀態進行修飾，如Xist，Air等。

2.2. 轉錄調控
在真核細胞中，轉錄因子對于基因轉錄非常重要，它們可以結合到基因轉錄產生的RNA上，控制RNA轉錄、定位和穩定性。一些lncRNA會作為配基，與一些轉錄因子結合，形成復合體，控制基因轉錄活性。例如，由一個超保守區域轉錄產生的lncRNA Dlx6os1既可以作為antisense RNA控制Dlx6表達，也可以通過募集DLX2或MECP2蛋白調控Dlx5和Gad1的表達。還有一些lncRNA本身就是轉錄因子。例如，lncRNA HSR1可以同HSF1、eEF1A共同形成復合物，在細胞熱休克應激反應時調節熱休克蛋白表達。另一個例子中，lncRNA GAS5會折疊成一個類似糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）DNA結合位點的結構，同GR互作，進而阻止GR發揮調控作用。在最近的研究中，有學者發現一些增強子也會通過轉錄產生RNA（enhancer RNA，eRNA），對特定方向距離較遠的基因進行調控，不過，eRNA發揮調控作用的機制尚未確定。

2.3. 轉錄后調控
除了上述兩種機制，lncRNA還會直接參與到mRNA轉錄后調控過程中，包括可變剪切、RNA編輯、蛋白翻譯及轉運等過程中。這些過程對于基因功能多態性非常重要。參與mRNA轉錄后調控的主要為antisense lncRNA，在mRNA可變剪切調控過程中，antisense lncRNA會與mRNA互補區域結合，影響某些剪切位點募集剪切體，控制mRNA剪切過程，同時也會對RNA編輯（A-to-I）產生影響。在mRNA核轉運及胞內定位過程中，也有一些antisense lncRNA同mRNA互作，發揮調控作用。

2.4. 調控miRNA
除了直接調控mRNA，lncRNA還會通過控制miRNA表達來影響其靶基因的表達量。在一些腫瘤細胞和特定組織中，一些lncRNA會攜帶有某些miRNA的“種子序列”，像海綿一樣結合miRNA，從而阻止miRNA同其靶mRNA結合。

總結起來，雖然關于lncRNA調控作用已經有很多研究，但目前還有很多關鍵問題沒有解決，比如說，細胞如何平衡調控miRNA和lncRNA的表達、lncRNA如何得到結合miRNA的信號等。隨著對lncRNA研究越來越深入，研究者也將發現更多lncRNA調控模式。

lncRNA功能示意圖 來源：Yang G, Lu X, Yuan L. LncRNA: A link between RNA and cancer[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2014.

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3. lncRNA與疾病

從現有研究成果中發現，基因表達的每一個階段幾乎都有lncRNA參與調控，lncRNA擁有信號分子（signal molecule）、誘餌分子（Decoy molecule）、引導分子（Guide molecule）和骨架分子（Scaffold molecule）等不同角色。眾多證據也表明許多疾病的發生也與lncRNA的突變或失調有關，這種變化能夠作為疾病診斷的標志物和潛在的藥物靶點，對它們的研究將有助于開發新型靶向治療方案，具有重要意義。

下表列出近些年來部分疾病相關lncRNA研究成果

4. 研究策略

在設計lncRNA相關研究課題時，要根據已有研究背景，合理設計研究策略。隨著高通量技術及分析手段的不斷發展，lncRNA研究方法不斷進步，研究者已可以根據不同的研究目的，設計完善合理的研究策略，獲得最有價值研究信息。下圖羅列了目前lncRNA研究主要研究策略，研究者可以此表為參考進行課題設計
。

4.1. 差異篩選
高通量技術的發展，為疾病組織與正常組織之間的差異lncRNA初步篩選提供了強有力的工具，目前，主要的篩選工具是高通量測序（Next Generation Sequencing，NGS）及生物芯片。

生物芯片通過參考已有的數據信息，針對每個轉錄本設計探針，通過探針和轉錄本反轉錄產生的cDNA之間的雜交，判斷不同樣本之間的轉錄本表達差異。在進行lncRNA芯片檢測時，通過選擇不同容量的芯片，設計合適的探針，可以同時檢測lncRNA和mRNA表達量，可對二者之間的表達關系進行分析。生物芯片本質上是核酸雜交，整個芯片系統也是一個封閉的系統，不能檢測探針沒有覆蓋到的區域；而近些年來逐漸流行起來的NGS，是一個開放的系統，理論上講，按照流程，不管有沒有參考序列信息，都可以進行檢測（de novo和re-sequencing）。所以，生物芯片不能發現新的lncRNA，而NGS則可以發現一些未知lncRNA。

高通量技術不同于高數量技術，它的優勢在于同時檢測成千上萬個基因或轉錄本，并非同時檢測成千上萬個樣本。如果只是想檢測有限的幾個lncRNA表達差異，大可不必選擇高通量技術，通過一代測序及qPCR即可達到篩選目的。而對于生物芯片或NGS篩選出的表達差異，也需要通過一代測序、qPCR、Northern Blot及RNA-FISH等技術手段進行驗證，以確保篩選準確度。

4.2. 數據分析
如果說初步篩選主要是硬件層面選擇的話，數據分析則是軟件層面比拼，分析方法和內容直接決定了原始數據利用率。目前lncRNA研究主流的數據分析包括表達差異lncRNA分析、新lncRNA預測、lncRNA-mRNA共表達網絡構建等，高級分析包括基因融合、RNA編輯、SNP分析、lncRNA功能預測等內容。研究者可根據自己的研究目的，自由定制分析內容，最高效率利用數據。

4.3. 機制探索
初步篩選與生物信息分析完成后，需要對所獲得的差異lncRNA進行功能和調控機制上的探索。功能研究主要包括功能獲得（gain of function）和功能缺失（loss of function）研究。在功能獲得研究中，主要利用lncRNA過表達載體，在細胞中特異性上調lncRNA，結合其他技術來檢測細胞表型及內部變化，包括染色質組蛋白變化（ChIP-Seq/ChIP-on-chip/ChIP-qPCR等）、RNA結合蛋白變化（RIP-Seq等）、“miRNA”海綿效應（miRNA表達譜芯片等）等，以確認lncRNA過表達對細胞的影響；而在進行功能缺失研究時，則主要采用RNAi的方法，包括設計siRNA、構建shRNA載體等手段，沉默lncRNA，再考察細胞變化。

對于lncRNA表達出現差異的機制研究，思路同mRNA差異分析類似，主要是從基因組蛋白表觀修飾狀態、DNA甲基化狀態及重要轉錄因子結合模式等方面考察，所用到的實驗手段包括ChIP-Seq、BS、熒光素酶重組子驗證等。

完成lncRNA功能及調控機制的研究后，可基本確認lncRNA從哪里來，到哪里去，接下來需要結合研究目的，進行其他方向的功能研究，如lncRNA對細胞凋亡、lncRNA對癌細胞轉移的影響等內容。最后，需要利用活體實驗驗證體外功能，一般選擇小動物活體成像平臺，通過設計動物用siRNA或過表達載體，靶向改變動物體內特定范圍的lncRNA表達量，觀察動物體內變化，如腫瘤大小、癌細胞轉移情況等。對于有條件的研究者，也需要在進行功能研究時輔以臨床數據驗證，可更有說服力地證明lncRNA是否能夠在未來成為一個新藥開發的特殊靶點。

延伸閱讀：

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