2008年10月8日，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉。日本科學(xué)家下村修、美國(guó)科學(xué)家馬丁•查爾非和錢(qián)永健因發(fā)現(xiàn)和改造綠色熒光蛋白（GFP）而獲獎(jiǎng)。因諾貝爾獎(jiǎng)和錢(qián)永健，熒光蛋白再次成為我們關(guān)注的熱點(diǎn)。1962-2009，這47年來(lái)，熒光蛋白也在不斷進(jìn)化。不過(guò)這種進(jìn)化不是出于自然選擇，而是成像上的壓力。

讓我們先來(lái)了解一些關(guān)于始祖GFP的基本情況。GFP由238個(gè)氨基酸組成，分子量為26.9 kDa，最初是從維多利亞多管發(fā)光水母（Aequorea victoria）中分離出來(lái)的，在藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光。來(lái)源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分別有主要和次要的激發(fā)峰，它的發(fā)射峰在509 nm，處于可見(jiàn)光譜的綠色區(qū)域。來(lái)源于海腎的GFP只在498 nm有單個(gè)激發(fā)峰。

GFP是典型的β桶形結(jié)構(gòu)，包含β折疊和α螺旋，將熒光基團(tuán)包含在其中。嚴(yán)密的桶形結(jié)構(gòu)保護(hù)著熒光基團(tuán)，防止它被周圍環(huán)境淬滅，內(nèi)部面向桶形的側(cè)鏈誘導(dǎo)Ser65–Tyr66–Gly67三肽環(huán)化，導(dǎo)致熒光基團(tuán)形成。

1962年，下村修和約翰森從維多利亞多管水母中分離生物發(fā)光蛋白-水母素（aequorin）時(shí)，意外地得到了一個(gè)副產(chǎn)物。它在陽(yáng)光下呈綠色、鎢絲下呈黃色、紫外光下發(fā)強(qiáng)烈綠色。其后他們仔細(xì)研究了其發(fā)光特性。1974年，他們得到了這個(gè)蛋白，當(dāng)時(shí)稱綠色蛋白，以后稱綠色熒光蛋白（GFP）。GFP在水母中之所以能發(fā)光，是因?yàn)樗�母素和GFP之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。水母素在鈣刺激下發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移到GFP，刺激GFP發(fā)光。這是物理化學(xué)中已知的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)在生物中的發(fā)現(xiàn)。

研究者們并沒(méi)有意識(shí)到GFP的應(yīng)用前景，慢慢就將其遺忘了。這一晃就是20年。直到1992年，道格拉斯•普瑞舍克隆并測(cè)序了野生型的GFP，文章發(fā)表在《Gene》雜志上。但具有諷刺意味的是，基金評(píng)審委員會(huì)認(rèn)為普瑞舍的工作沒(méi)有意義，不愿提供經(jīng)費(fèi)。普瑞舍一氣之下，離開(kāi)了科學(xué)界，將GFP的cDNA送給了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室。很多人嘗試用GFP的基因來(lái)表達(dá)蛋白，但都失敗了。馬丁•查爾非就考慮只用它的編碼區(qū)域來(lái)表達(dá)。他用PCR的方法擴(kuò)增了GFP的編碼區(qū)，將它克隆到表達(dá)載體中，通過(guò)UV或藍(lán)光激發(fā)，在大腸桿菌和線蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)均產(chǎn)生了很美妙的綠色熒光。這才是GFP作為熒光指示劑的真正突破，文章發(fā)表在《Science》雜志上。

盡管野生型GFP發(fā)出很絢麗的熒光，但它還是有不少缺點(diǎn)，比如有兩個(gè)激發(fā)峰、光穩(wěn)定性不好，在37℃不能正確折疊。

1996年Remington小組最先在《Science》上發(fā)布了GFP的S65T突變體的晶體結(jié)構(gòu)。一個(gè)月后，Phillips小組也在《Nature Biotech》上發(fā)布了野生型的GFP結(jié)構(gòu)。正是這些晶體結(jié)構(gòu)的探明，才使人們更好地了解發(fā)光基團(tuán)的組成，以及與周圍殘基的相互作用。研究人員通過(guò)定點(diǎn)或隨機(jī)突變，不斷地改造這些殘基，得到了我們今天使用的GFP衍生物。

首個(gè)重大改變就是錢(qián)永健在1995年完成的單點(diǎn)突變（S65T）。這個(gè)突變顯著提高了GFP的光譜性質(zhì)，熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)。突變后的GFP激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488 nm，而發(fā)射峰仍保持在509 nm，這和常用的FITC濾光片匹配，提高了GFP的應(yīng)用潛力。而F64L點(diǎn)突變則改善了GFP在37℃的折疊能力，綜上就產(chǎn)生了增強(qiáng)型GFP，也就是我們常見(jiàn)的EGFP。

熒光蛋白的改造遵循這樣一個(gè)宗旨，那就是越紅越好。普遍認(rèn)為，長(zhǎng)波長(zhǎng)光子的激發(fā)對(duì)細(xì)胞和組織的光毒性小，且自體熒光和動(dòng)物組織的光吸收都是最小。這些因素意味著紅色的熒光基團(tuán)對(duì)比度提高（因?yàn)楸尘皯?yīng)該降低），且更適合于體內(nèi)成像。于是，熒光蛋白的改造慢慢向紅色偏移。最初是黃色熒光蛋白，1999年人們?cè)阢y蓮花中發(fā)現(xiàn)了橙紅色的熒光蛋白同源物，稱之為DsRed（發(fā)射峰在583 nm）。DsRed的出現(xiàn)讓研究人員認(rèn)識(shí)到熒光蛋白的多樣性，同時(shí)也有了更豐富的改造模板。之后，更長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光蛋白也陸續(xù)出現(xiàn)，如mStrawberry、mCherry（2004）、mApple（2008）、mRuby（2009），它們的名字也都相當(dāng)動(dòng)聽(tīng)。

對(duì)于活體動(dòng)物成像而言，最好工具是遠(yuǎn)紅外熒光蛋白。然而，要產(chǎn)生遠(yuǎn)紅外熒光，這些蛋白需要被600 nm左右或以上的光激發(fā)，但這些光在到達(dá)深處的組織之前，就已被血紅蛋白大幅度減弱。因此，到現(xiàn)在為止還未開(kāi)發(fā)出激發(fā)光譜在700 nm附近的熒光蛋白。遠(yuǎn)紅外熒光蛋白的開(kāi)發(fā)遇到了瓶頸。

實(shí)際上，大自然蘊(yùn)含的豐富資源已經(jīng)解決了這個(gè)問(wèn)題，只是我們不知道而已。錢(qián)永健的實(shí)驗(yàn)室最近揭開(kāi)了謎底。他們沒(méi)有像慣常一樣，從紅色熒光蛋白開(kāi)始，將它們改造得更亮，而是從一種新的骨架來(lái)開(kāi)發(fā)紅外熒光蛋白。他們從一種耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的細(xì)菌光敏色素骨架入手，這種光敏色素吸收700 nm左右的光。它還結(jié)合了一種名為膽綠素的輔因子，作為發(fā)色團(tuán)。

利用飽和突變和DNA改組（DNA shuffling）來(lái)改變膽綠素發(fā)色團(tuán)的蛋白殘基，錢(qián)永健及他的同事們發(fā)現(xiàn)了一種光穩(wěn)定的紅外熒光蛋白突變單體，它的激發(fā)波長(zhǎng)是684 nm，發(fā)射波長(zhǎng)是708 nm。當(dāng)他們利用腺病毒載體在小鼠肝臟表達(dá)這種突變體時(shí)，觀察到強(qiáng)烈的紅外熒光。

除了體內(nèi)成像應(yīng)用，這種紅外熒光蛋白還能用于細(xì)胞成像。它的顏色與目前存在的熒光蛋白不同。而且，紅外區(qū)域的細(xì)胞自體熒光幾乎是不存在的，因此提供了更清晰的圖像。此外，它還能在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）中發(fā)揮作用。錢(qián)永健實(shí)驗(yàn)室的研究人員表示，紅外熒光蛋白應(yīng)該不會(huì)局限于耐輻射奇球菌的光敏色素，還存在許多種細(xì)菌光敏色素，它們的吸收最大值在650到750 nm之間。這些也是紅外熒光蛋白的有力候選，它們能用于多色成像、以及體內(nèi)FRET成像的供體或受體。

綠色熒光蛋白不再是孤獨(dú)的，它有了橙色、紅色等多種熒光蛋白的陪伴。然而，要找到個(gè)“門(mén)當(dāng)戶對(duì)”的伴侶也不容易。就融合應(yīng)用、亮度、光穩(wěn)定性而言，與EGFP相似的還真沒(méi)有。而且，一些紅外熒光蛋白仍保留了基本的綠色熒光組件，因此不可能與EGFP一起應(yīng)用于兩色成像。科學(xué)家的近期目標(biāo)是開(kāi)發(fā)出與EGFP各方面都匹配的紅色熒光蛋白。當(dāng)然，紅色熒光蛋白變異體的改造仍在持續(xù)。

熒光蛋白已經(jīng)給生物學(xué)帶來(lái)了很多驚喜。通過(guò)常規(guī)的基因操縱手段，用熒光蛋白來(lái)標(biāo)記其他目標(biāo)蛋白，這樣就可觀察、跟蹤目標(biāo)蛋白的時(shí)間、空間變化，提供了以前不能達(dá)到的時(shí)間和空間分辨率，而且可以在活細(xì)胞、活體動(dòng)物中觀察到一些分子。熒光蛋白甚至協(xié)助了HIV研究。

德國(guó)的研究人員就開(kāi)發(fā)出一種光轉(zhuǎn)變熒光蛋白（photoconvertible fluorescent protein），能觀察HIV在感染的細(xì)胞中如何裝配及釋放。這種名為EosFP的光轉(zhuǎn)變蛋白發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，在紫外照射下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。紫外光通過(guò)打斷發(fā)色團(tuán)旁邊的肽骨架而改變了蛋白的發(fā)射波長(zhǎng)。這樣EosFP就稱為一種極佳的失蹤標(biāo)記。研究人員將EosFP與HIV的結(jié)構(gòu)蛋白-Gag相連，實(shí)時(shí)追蹤了病毒顆粒在感染的細(xì)胞膜上如何裝配并釋放。光轉(zhuǎn)變熒光蛋白讓研究人員又多了一種選擇。

熒光蛋白的下一個(gè)驚喜將會(huì)是什么？我們無(wú)法回答，但我們期待著。