在細胞生物學領域，由于熒光激發與檢測對細胞形態及生理的影響較小，因而當之無愧地成為研究細胞結構與功能首選的示蹤方法之一。五花八門的細胞器熒光探針是細胞學研究中重要的一種工具，大概有幾百種之多。說到熒光探針，Molecular Probes絕對是一塊“誰與爭鋒”金字招牌，2003年被Invitrogen收歸旗下。盡管宣傳不多，但分子探針這一塊的銷售額還是隨著細胞學研究的進展而節節攀升。沒辦法，跟著文獻走，文獻中盡是它。下面這張漂亮的圖上標出的細胞器，Invitrogen都有相應的探針。篇幅有限，生物通特意挑選了幾個熱門的細胞器，介紹一些明星探針。還有更多精彩等著你來發現。。。

線粒體是細胞的能量工廠。因其參與了細胞凋亡，這些年也成為研究的熱門。線粒體的熒光探針主要有：JC-1、Rhodamine 123等，Invitrogen還推出專門的MitoTracker® 系列探針。

JC-1是用得最多的。它在濃度或線粒體膜電位低時，以單體存在，激發波長為490 nm，發射波長為527 nm，呈綠色熒光。當濃度升高或線粒體膜電位升高時，JC-1形成J-聚體，呈橙色熒光，此時激發波長為490 nm，發射波長為590 nm。JC-1最重要的應用是檢測活細胞內線粒體的膜電位，以及追蹤凋亡細胞中的線粒體變化。

Rhodamine 123是一種能滲透入細胞，帶陽離子的熒光探針。它的激發波長為505 nm，發射波長為534 nm。活細胞攝取Rhodamine 123達到平衡的速度較快，只需5分鐘，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，即可見到線粒體被Rhodamine 123染成綠色。當細胞被反復沖洗時，Rhodamine 123通常不被細胞保留，但許多癌細胞可較長時間保留這種染料，因此，它有助于某些癌癥的診斷。

MitoTracker® 系列探針則是Invitrogen專為線粒體而設計的。MitoTracker是細胞通透性的，只要與細胞簡單孵育，就能被動滲透質膜，在有活性的線粒體中積累。一旦線粒體被標記，細胞就能用甲醛固定劑固定，一些MitoTracker探針能在固定之后保留在線粒體內。這對致病細胞格外有用。而一些探針在隨后的去污劑處理后還能保留，這樣就能用在免疫細胞化學或原位雜交中。盡管傳統的線粒體探針如Rhodamine 123也很容易標記線粒體，但是一旦線粒體的膜電位損失，它們就很容易被洗掉。這就限制了某些應用。

MitoTracker探針又分為好幾種，且有紅色、綠色和橙色。其中還原態的MitoTracker Orange CM-H2TMRos和MitoTracker Red CM-H2Xros在進入細胞后不發出熒光，直到它們被氧化成相應的線粒體選擇性探針，并聚集在線粒體內。紅色的MitoTracker探針都適合于多色標記實驗，因為它們的紅色熒光能與其他綠色熒光很好地區分開。盡管有些MitoTracker探針能實現固定細胞中的線粒體標記，但這些染料還是只推薦給活細胞。如果你想要標記固定細胞，可以選擇OxPhos的抗體+熒光二抗。

內質網

內質網的功能有哪些？你還記得嗎？復習一下，內質網是細胞中由膜圍成的分支小管、小囊或扁平囊狀結構連通而成的管道系統，可分為粗面內質網和滑面內質網兩種。粗面內質網上附著有核糖體，是合成蛋白質的主要場所；滑面內質網則功能多樣，比如在肝細胞中與解毒和糖代謝有關。

常用的DiOC6(3) 及相似的DiOC5(3) 都屬于短鏈羰花菁染料，它們廣泛用于內質網的研究，包括神經元、酵母中內質網的結構作用和動力學，以及不同細胞類型中內質網、線粒體和微管的形態關系。它們不僅可標記活細胞中的內質網，也可以用于甲醛固定的細胞。DiOC6(3) 進人細胞內與內質網結合，在激光激發下發出綠色熒光，根據內質網的形態學特征很容易識別。需要注意的是，在相對低濃度時，DiOC6(3) 聚集在線粒體中，而在高濃度時，則可聚集于其他膜性細胞器，包括內質網膜。

長鏈的羰花菁染料DiIC16(3) 和DiIC18(3) 也可以標記內質網膜。DiIC16(3) 的激發波長為550 nm，發射波長為564 nm；DiIC18(3) 的激發波長為550 nm，發射波長為565 nm，均呈黃色熒光。DiIC16(3) 和DiIC18(3) 的分子結構與DiOC6(3) 大致相同。DiIC16(3)有兩個更長的碳鏈，使Dil不能透過膜。一旦DiI 結合到膜內，它就保留膜中，在膜的兩層內自由擴散。DII 已經用來標記神經元細胞和肌細胞的內質網。

ER-Tracker染料是Invitrogen開發的細胞通透性的活細胞染料，是ER高度選擇性的。它們與常規的ER染料DiOC6(3)不同，很少會對線粒體染色，且低濃度下的染色不會對細胞帶來毒性。ER-Tracker Blue-White DPX屬于Dapoxyl染料家族中的一員，因此有著相當大的斯托克斯位移，長發射波長，以及高的消光系數和量子產率。它的熒光對環境極其敏感，當溶劑極性增加，熒光發射峰會移向更長的波長-從430 nm到640 nm，量子產率下降。Invitrogen推薦用標準的DAPI或UV longpass濾光片來觀察它的內質網染色。ER-Tracker Green和ER-Tracker Red的激發/發射峰分別為504/511 nm和587/615 nm。

真菌代謝物brefeldin A (BFA) 是解析多個胞內進程的重要工具，包括參與運輸新合成蛋白的囊泡形成及驅動蛋白分布。將細胞暴露在BFA中，會引起細胞內從內質網到高爾基體的蛋白轉運的失常，最終導致高爾基體形態的喪失，而去除BFA后，這些作用會完全逆轉。除了天然的BFA外，Invitrogen還提供了綠色和橙紅色的BFA衍生物。綠色的BODIPY FL和橙紅色的BODIPY 558/568 BFA衍生物能夠在幾種細胞系中對內質網和高爾基體進行選擇性染色。BODIPY 558/568 BFA可與NBD C6-ceramide共同使用，來同時了解內質網和高爾基體。

高爾基體

高爾基復合體的功能主要是將由粗面內質網運來的蛋白類物質進行加工、濃縮、儲存和運送，最后形成分泌泡排除。高爾基復合體的熒光探針主要有NBD C6-Ceramide 和BODIPY FL C5-Ceramide 兩種。

NBD C6-Ceramide呈綠色熒光，激發波長為464 nm，發射波長為532 nm，是目前應用較廣泛的選擇性染色高爾基復合體的探針。它適用于活細胞和固定細胞的染色。將熒光ceramide與BSA混合，有助于細胞標記，而無需使用有機溶劑來溶解探針。NBD C6-Ceramide 目前應用在以下方面的研究：檢測BFA對高爾基復合體和內質網之間的蛋白轉運的作用效果；一種遺傳性脂代謝異常的疾病（Farber’s疾病）的研究；細胞內凝血酶受體的轉運和標記等等。

另外，NBD C6-Ceramide的熒光對高爾基體的膽固醇含量特別敏感，這個現象是BODIPY FL C5-Ceramide所沒有的。如果含有NBD C6-Ceramide的細胞是膽固醇饑餓的，那么高爾基體中積累的熒光特別不穩定。不過，膽固醇合成的刺激會降低這種NBD光漂白。因此，NBD C6-Ceramide在監測活細胞中高爾基體的膽固醇含量時很有用。

BODIPY FL C5-Ceramide也呈綠色熒光，激發波長為505 nm，發射波長為511 nm。它比NBD衍生物更加明亮，且不容易衰減，因此在很多應用中都能夠替代NBD C6-Ceramide。BODIPY FL C5-Ceramide表現出濃度依賴的熒光特性。在高濃度，非極性的BODIPY FL熒光基團形成受激準分子，使熒光基團的發射峰從515 nm（綠色）轉移到620 nm（紅色）。反面高爾基體上的BODIPY FL C5-Ceramide積累足夠形成受激準分子，而周圍的細胞質不會。利用紅光的濾光片就能選擇性觀察高爾基體。而且，這種二色性還能通過比例成像定量BODIPY FL C5-Ceramide的積累。

溶酶體

溶酶體為單層膜蛋白包圍的內含一系列酸性水解酶的小體。溶酶體中含有多種酶，如糖苷酶、酸性磷酸酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶等等，是物質代謝的場所。

弱堿性胺選擇性聚集在胞內低pH值的小室中，可用于研究溶酶體的生物合成和發病機理。其中最常用的就是DAMP，它不發熒光，需要和抗DNP的抗體共同使用，來觀察染色模式。中性紅、吖啶橙等熒光探針也常用于酸性細胞器的染色，不過它們缺乏特異性。

LysoTracker探針就是Invitrogen開發的向酸性熒光探針，用于標記和追蹤活細胞中的酸性細胞器。這些探針有幾個重要的特征：對酸性細胞器的高選擇性，在納摩爾濃度下能對活細胞有效標記。而且，LysoTracker探針有幾種不同的顏色，適合多色標記。

LysoTracker探針是細胞膜通透性的，一般聚集在球形的細胞器中。研究人員發現探針在極低濃度（～50 nM）下選擇性最佳。此外，較大的酸性細胞器在LysoTracker Red DND-99染色后，經過甲醛固定仍保留其染色模式。

對于那些想研究溶酶體生物發生動力學的研究人員來說，LysoSensor探針可謂量身定做。LysoSensor染料是向酸性的探針，由于質子化作用聚集在酸性細胞器中。質子化也緩解了染料的熒光淬滅，使熒光強度增加。因此，LysoSensor在酸化的環境中表現出pH依賴的熒光強度增加，而LysoTracker探針的熒光則沒有明顯變化。

Invitrogen提供了5種LysoSensor試劑，pKa不同，顏色各異。LysoSensor Blue DND-167和LysoSensor Green DND-189的pKa值很低，處于酸性環境中才會發出熒光，而LysoSensor Green DND-153在中性pH下就發出很強的熒光。LysoSensor Yellow/Blue DND-160很特別，具有雙激發和雙發射峰，是pH依賴的。在酸性細胞器中，它主要發黃色熒光，而在弱酸性細胞器中，熒光則為藍色。LysoSensor Yellow/Blue DND-160曾與fluo-3 AM共用，來同時測量兔胃腺中H+ 和Ca2+，以確定類膽堿和cAMP依賴通路激活后胃酸分泌的動力學。

除了上面這些傳統的熒光探針，Invitrogen的Organelle Lights™熒光蛋白也是一個不錯的選擇。Organelle Lights是即用型的熒光蛋白載體，融合了信號肽，能將表達的熒光蛋白定位到亞細胞器中，如核、質膜、內質網、高爾基體和過氧化物酶體等等。顏色有青、綠、橙、紅幾種。它通過改造的可用于哺乳動物細胞的桿狀病毒（BacMam virus）將熒光蛋白導入胞內，不僅安全，而且適合多種細胞類型，包括原代細胞和神經細胞。你只需要將試劑加到細胞中就行了，既不需要轉染，也不需要對細胞做任何處理，用起來相當方便。

講了這么多，還只是冰山一角。毫無疑問，花樣繁多的熒光探針為我們在細胞學研究中提供的更多的選擇，不單止美麗，不單止有趣，更照亮了研究的前進之路。如果你希望了解更多其他細胞器的熒光探針，可以點擊此處向Invitrogen索取相關的資料。各種細胞器探針的超詳細分析，不怕找不到，總有一款合適你吧。更多精彩等著你來發現……（生物通 余亮）

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