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    生物通首頁 > 今日動態 > 專題總匯 > 全球訪談紀要:PacBio RS第三代單分子測序系統
    引言
            第三代單分子測序概念一經提出,就在全球范圍內引起了巨大反響,被譽為“未來測序應用的基準線”。
            作為第三代測序技術的代表,也是目前唯一面市的PacBio RS系統,自發售至今走過了最不平凡的25個月。
            期間,幾經褒獎,幾經質疑。
            有人說,它是“革命性的儀器”,讓人類首次領略了單分子合成觀測的魅力。
            也有人說,它“門檻太高、應用太窄”,是個奢侈品,無法在常規場合進行推廣。
            有人說,它“粗曠而不失細膩”,既能長讀長覆蓋,又能實時動態記錄單堿基信息。
            也有人說,它“眼高手低”,高錯誤率似乎是個硬傷。
            期間,昔日的同門逐漸淡出江湖。
            Helicos已申請破產保護,Complete Genomics難逃被收購的命運,Oxford Nanopore雖然呼聲很高,但宛若空中樓閣遲遲不見現身。唯有PacBio還在奮力前行。
            業界騷動!!不是為了二代測序保住了市場而歡呼,而是為了三代測序的命運坎坷而憂愁,更是為了PacBio的碩果僅存而思考。
            “它到底還能走多遠,它到底能走得多好?!”
            問這個問題的人很多,有專家,有媒體,有在用用戶,有觀望用戶,還有大批熱衷于新技術的科研粉絲。
            特此收集了PacBio問世以來的一些媒體采訪、專家點評、用戶心得、官方發言,以主題形式匯編梳理,期望用“原汁原味”的方式,為您呈上2013年的一道“訪談燴菜”。作為談資也罷,作為解惑也罷,只要您曾經關注過第三代測序,或者正在關注第三代測序。

    PacBio公司創始人
    Stephen Turner


    PacBio公司創始人
    Jonas Korlach



          主題一:PacBio單分子實時測序技術存在的價值


    Broad研究院把PacBio RS系統作為基因分型驗證的首選工具
            我們分別利用PacBio平臺和Illumina MiSeq平臺進行對比驗證,結果發現PacBio數據有著更好的準確性和假陽性檢出率,相對而言是一種更為有效的驗證工具。
    ——Mauricio Carneiro(美國Broad研究院醫療和人口遺傳學項目組計算生物學家)
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    如何正確看待錯誤率和測序數據質量
            隨機錯誤是相對比較容易用概率算法進行修正的,但修復系統性誤差就不是統計學能夠解決的范疇了。……我們開發的算法將PacBio錯誤率從15%減少為不到千分之一。
    ——Michael Schatz(美國冷泉港實驗室沃森生物科學學院定量生物學助理教授)
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    擁有高質量參考基因組和缺口修復工作的重要性
            大量的基因組空白區域中可能存在重要的生物學信息,如果無法補齊Gap,不僅不能獲得完整的基因圖譜,還會給后續的關鍵信息解讀造成很大的困難。
    ——Richard Gibbs(美國Baylor醫學院人類基因組測序中心總監)
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    PacBio在揭示德國大腸桿菌疫情爆發菌株中的突出作用
            在此項目證實了PacBio在復雜微生物病原體的de novo測序的能力,以及在多個基因組快速測序上的威力,這些有助于闡明病原體微生物的進化史。
    ——Eric Schadt(美國西奈山醫院基因組學和多尺度生物學研究所總監)
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    PacBio RS系統全球用戶總評
            為了維持基因組學的前沿地位,我們探索基因組測序中的新機會。我們計劃使用PacBio來改善病原體的de novo拼接,并提高一些物種的序列信息覆蓋度,在未來,我們將通過甲基化位點的直接檢測來探索表觀遺傳學。
    ——Harold Swerdlow(英國Sanger研究院研發部總監)
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          主題二: PacBio RS系統在de novo測序中的優勢


    利用PacBio RS系統獨立完成微生物de novo完整測序
            在羊病微生物基因組de novo測序項目中,我們利用PacBio大于6 Kb的讀長數據,只用了20X覆蓋度就拼出了1個Contig,而且這一個Contig即是一條染色體。

    ——Timothy Smith(美國農業部肉類動物研究中心分子遺傳學專家)
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    PacBio系統結合二代測序技術進行高等基因組的混合拼接
            我們研究組先用Illumina數據拼出了Rhodobacter細菌的Scaffold,然后用PacBio的長讀長數據去填補Gap。在加入PacBio數據之前,一個Scaffold包含22個Contig,加入PacBio數據后,結果立即改觀,拼成了一個巨大的Contig。

    ——David Jaffe(美國Broad研究院計算研發部總監)
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    PacBio系統適用的混合拼接和獨立組裝軟件介紹
            我們專門開發了高度自動化的工具PBJelly,能夠將PacBio長片段與基因組草圖進行比對,填補或減少草圖中的缺口,從而完善基因組草圖。

    ——Adam English(美國Baylor醫學院人類基因組測序中心生物信息學家)
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          主題三: PacBio RS系統首次實現對堿基修飾進行直接測序


    堿基修飾直接測序法的經典案例
            你可以通過監測DNA合成得到堿基序列信息,同時,你還額外得到了每個堿基如何摻入的動力學信息。我們用PacBio對E.coli O104:H4菌株進行了“前所未有的全基因組甲基化譜分析”,共發現了50,000多個甲基化位點。

    ——Matthew Waldor(美國霍華德休斯醫學研究所研究員)
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    堿基修飾直接測序法的原理
            這就好比是開車經過減速帶,一個凸起的路障會干擾車速。每種堿基修飾事件都會使聚合酶的“停頓模式”產生微小差異,最終反映到熒光脈沖信號的間隔上。

    ——Stephen Turner(美國PacBio公司創始人兼CTO)
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    直接測序法分析甲基化組學(Methylome)的先行者
            通過與PacBio合作完成的全基因組甲基化譜分析,我們可以找到甲基化酶的識別序列,無論是什么甲基化酶,只要它在那。這真是我們首次有能力對細菌基因組進行全方位的甲基化組學分析。

    ——Richard Roberts(1993年諾貝爾生理學或醫學獎得主,現為美國NEB公司CSO)
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    化學標記富集法推動堿基修飾直接測序
            我們就是想把5-hmC的檢測變得敏感些,最容易想到的是,加個標簽以便富集信號。通過這個試劑盒,不光可以檢測出羥甲基化修飾,還可以顯著降低檢測覆蓋度。

    ——Chuan He(美國芝加哥大學生物物理動力學研究院總監)
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    堿基修飾直接測序法適用軟件和其他應用案例
            目前軟件可以自動識別5-mC、4-mC、6-mA等堿基修飾,其它堿基修飾可參照相關文獻通過設立對照進行檢測。我們還將對軟件不斷進行升級,2013年陸續推出其他各種堿基修飾類型。

    ——Edwin Hauw(美國PacBio公司產品管理高級總監)
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          主題四: PacBio RS系統在靶向測序和臨床診斷中的獨到應用


    SNP和Indel變異驗證、廣義單倍體型分析
            PacBio單分子測序技術能對基因組中的低頻變異進行高效解讀,且能夠有效彌補Sequenom和Sanger方法的缺陷,可以尋找除已知位點以外的其他漏檢稀有突變。

    ——Matthew Meyerson(美國Broad研究院高級成員)
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    串聯重復突變和低頻突變檢測
            我們一開始也不敢確定PacBio是否能應付,但實際使用下來,我們低估了PacBio,在單分子檢測條件下,我們竟然能檢測到最低至2.7%的突變。

    ——Neil Shah(美國加州大學舊金山分校醫學院血液科副教授)
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    三聯核苷酸異常擴增分析
            我們證實了PacBio可以測超過750個CGG重復片段,并能夠精確定位AGG突變。這種方法保障了單堿基分辨率,今后也能完整鑒定所有與疾病相關的等位基因,從而有利于準確及時的臨床診斷。

    ——Paul Hagerman(美國加州大學戴維斯分校醫學院生物化學和分子醫學教授)
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    mRNA可變剪切和病毒變異分型
            而單分子測序則不同,其生成的長片段能一次性完成通讀,有助于在大范圍內對可變剪切位點進行直接分析。此外PacBio的CCS測序模式能夠提供準確度非常高的序列數據,使得轉錄組可變剪切位點分析更加準確。

    ——Frederic Bushman(美國賓夕法尼亞大學微生物系教授)
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    臨床快速診斷實施和無需建庫方案
            由于周轉時間的限制,PacBio RS系統快速測序能力也是我們選擇它的一個主要原因。我們擁有PacBio快一年了,它確實用起來又快又方便。同時,PacBio的序列無偏好性測序的特點也是一個重要考慮因素。

    ——John McPherson(加拿大安大略癌癥研究所基因組技術總監)
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          主題五:PacBio的未來方向以及為測序帶來的變化?


    PacBio系統的已有升級和表現效果
            通過最近的軟件更新,PacBio RS系統可以產出超長讀長并實現超高精度的從頭組裝,這極大地改善了我們的發現能力,以便更經濟高效地獲得新型基因組信息。

    ——J. Craig Venter(全球知名生物學家及企業家,時代雜志2007/2008年將他選進世界上最有影響力的人之一)
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    PacBio系統的未來升級方向
            理想情況下,單分子邊合成邊測序反應完全可以做到大規模并行,DNA聚合酶的體外合成效率可以高達1毫秒/堿基。要克服光學技術壁壘,最有前途的方式是把生物現象轉化為電信號來檢測。

    ——Madoo Varma(美國Intel公司整合生物系統實驗室負責人)
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    總裁展望
            我們的客戶已經抓住了PiaBio的價值精髓,并開始不惜投入了。正是這些客戶將最終成為我們最好的銷售向導,而PacBio的獨特價值將逐漸引導客戶進入下一輪訂購潮。

    ——Michael Hunkapiller(美國PacBio公司主席兼CEO)
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    PacBio亞洲代理和測序服務公司
            我們非常榮幸能成為PacBio公司在中國大陸和香港的獨家經銷商,也非常期待能把這一突破性的創新技術帶入中國。PacBio RS系統正為我們展開全新的視角,我們同時盼望SMRT 技術能為中國測序界帶來前所未有的悸動。

    ——Cheung To(中國香港Gene Company Limited創始人兼主席)
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    近期相關會議推薦
            為全面總結疾病遺傳學和基因組學研究進展,探討后GWAS時代疾病發病機制研究的機遇與挑戰,推動轉化醫學發展,茲定于2013年5月16-18日在上海舉行第三屆《自然遺傳》疾病基因組學國際研討會(Workshop)。論壇由《Nature Genetics》(《自然遺傳》雜志)聯合安徽醫科大學,上海交通大學和復旦大學共同主辦,Myles Axton博士與張學軍教授共同任執行主席。論壇主題是“From GWAS to Precision Medicine”,主要圍繞復雜疾病的發病調控表達研究,復雜疾病全基因組關聯研究meta分析,復雜疾病表觀遺傳學研究,全基因組外顯子測序搜尋疾病遺傳變異及轉化基因組學研究。
            論壇將邀請來自《自然遺傳》、美國哈佛大學、美國華盛頓大學、美國科羅拉多大學、英國倫敦大學、英國鄧迪大學、新加坡國立大學,中國醫學科學院、上海交通大學、復旦大學、浙江大學、同濟大學、中山大學、中南大學及第二軍醫大學等國內外相關單位權威學者參會。PacBio公司創始人兼首席科技官Stephen Turner先生受邀參會,將在會議期間分享PacBio RS系統特有的單分子實時測序(SMRT)技術在后GWAS時代的創新應用。
            報告題目:Extremely Real Long Reads Using SMRT Sequencing as a Follow Up to Post-GWAS Candidate Regions
            報告人:Stephen Turner, Founder & CTO at Pacific Biosciences
            會議網址:http://www.natureasia.com/en/events/gwas-2013/


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