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Arraystar rG4芯片：解鎖RNA動態結構奧秘
【字體： 大 中 小 】 時間：2025年12月16日 來源：康成生物
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Arraystar rG4芯片技術不僅能夠有效捕獲和檢測活細胞中的rG4，同時也消除了DMS誘導的修飾所產生的偏差，從而顯著提高了rG4 定量圖譜分析結果的準確性和可靠性。
一、簡介
RNA G-四聯體 (RNA G-quadruplexes，rG4)是由富含鳥嘌呤 (G) 的RNA序列通過Hoogsteen氫鍵形成的一種非經典二級結構。該結構由堆疊的G-四分體平面構成，并由K⁺等單價陽離子穩定（圖1）。rG4的動態結構轉變可調控RNA轉錄[1]、染色質修飾因子募集[2]、miRNA前體加工[3]、mRNA翻譯[4, 5]以及 mRNA 穩定性[6]。此外，rG4 還能與m7G [3]、o8G[7]和m6A[8, 9]等 RNA 修飾共同調控基因表達。rG4形成發生失調，則會影響應激反應 [7]、癌癥基因表達調控 [10, 11]，并與帕金森病、路易體癡呆及多系統萎縮中發生的α-突觸核蛋白聚集有關[12]。
圖1. 在富含鳥嘌呤的RNA序列中，四個鳥嘌呤通過Hoogsteen鍵結合形成G-四分體平面，G-四分體平面堆疊形成RNA G-四聯體（RG4）[13]。
Arraystar rG4芯片技術可精準定量轉錄組中的rG4 結構。其中的關鍵步驟包括：體內硫酸二甲酯 (Dimethyl sulfate, DMS) 處理、體外RNA重折疊，以及使用抗G4抗體（BG4）進行親和性捕獲。隨后，將捕獲到的含有 rG4結構的 RNA進行去甲基化處理，以去除 DMS 處理所產生的副產物m1A/m3C，消除其造成的檢測干擾。最后，利用高靈敏度的Arraystar rG4 芯片探針對rG4-RNA進行定量分析。Arraystar rG4芯片技術不僅能夠有效捕獲和檢測活細胞中的rG4，同時也消除了DMS誘導的修飾所產生的偏差，從而顯著提高了rG4 定量圖譜分析結果的準確性和可靠性。
二、技術優勢
體內DMS處理與體外重折疊復現了真實的rG4結構
使用高親和性的BG4抗體特異性富集含有rG4結構的RNA
Demthylation處理去除了DMS 處理的副產物m1A/m3C所造成的檢測干擾
Arraystar 芯片可以靈敏的檢測rG4 RNA, 包括RNA測序無法準確檢測的低豐度RNA
三、實驗流程
圖2. rG4芯片實驗流程圖。
1. 體內 DMS 處理
培養細胞經硫酸二甲酯（DMS）處理，對 RNA 中的腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）及非 rG4折疊區域的鳥嘌呤（G）進行甲基化修飾。rG4 結構內的 G 堿基因空間位阻不受影響，從而保留其未甲基化狀態。
2. RNA 抽提與體外重折疊
分離總 RNA 并進行片段化處理，隨后在含K⁺的緩沖體系中經歷變性-復性過程。此步驟僅允許細胞內原有的 rG4 區域特異性重折疊，而其他區域由于攜帶m7G修飾，無法形成穩定結構。
3. rG4 免疫沉淀
利用抗 G-四聯體抗體（BG4）對含 rG4 結構的 RNA 進行免疫沉淀（IP），實現目標分子的特異性富集。
4. 去甲基化與反轉錄
富集的 RNA 經去甲基化酶處理，清除 DMS 誘導的副產物（如 m¹A/m³C），消除檢測偏差。隨后通過反轉錄合成雙鏈 cDNA，并引入T7 啟動子序列。
5. 熒光標記 cRNA 合成
以 cDNA 為模板，T7 RNA 聚合酶催化體外轉錄反應，摻入Cy3-CTP 熒光染料，生成帶Cy3 標記的反義 cRNA。
6. 芯片雜交與數據分析
標記的 cRNA 與Arraystar rG4 芯片雜交，通過熒光信號定量分析轉錄組中rG4 結構的分布與豐度。
四、芯片參數
Arraystar 人類 rG4 芯片參數
RNA G-quadruplex (rG4) 數據庫
參考文獻
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