腫瘤一直以來都困擾著人類健康。隨著腫瘤免疫學理論的深入研究和技術(shù)的不斷進步，腫瘤免疫治療有望實現(xiàn)腫瘤的根治性突破、成為腫瘤治療的主流方法。腫瘤免疫療法被稱為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種腫瘤療法，并于2013年被《科學》雜志評為年度最具價值的科學突破之一。腫瘤免疫療法中，CAR-T細胞療法備受矚目，截止到目前為止，國內(nèi)已上市8款CAR-T產(chǎn)品，全球已上市15款CAR-T產(chǎn)品。

CAR-T細胞療法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是CAR-T細胞的制備，慢病毒載體是CAR基因基因?qū)�入所使用的主要技術(shù)路線。CAR-T細胞的制備流程通常可被分為：外周血單核細胞（PBMC）采集，T細胞分離，T細胞激活，T細胞（體外）基因修飾，CAR-T細胞體外擴增，CAR-T細胞質(zhì)量監(jiān)控及回輸，共6個主要步驟。在一般的技術(shù)路線中，T細胞的激活和基因修飾是獨立分開的兩個過程。Takara Bio可以提供一種新型可溶性微流體轉(zhuǎn)導系統(tǒng)——Lenti-X™ T細胞轉(zhuǎn)導海綿，讓CAR-T細胞構(gòu)建更高效。

基于新型生物支架技術(shù)的T-Cell轉(zhuǎn)導海綿

Lenti-X T細胞轉(zhuǎn)導海綿，是一種新型可溶性微流體轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。依托于大孔徑的海藻酸鹽海綿狀3D結(jié)構(gòu)，可以做到一步完成T細胞活化和慢病毒轉(zhuǎn)導兩個過程，既提高了時效性，又減少了對細胞的處理過程，對轉(zhuǎn)導需要的病毒量也更小，能夠?qū)崿F(xiàn)高效活化、高效轉(zhuǎn)導、高細胞活力，具有高實驗穩(wěn)定性和重復性。

Lenti-X T細胞轉(zhuǎn)導海綿的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，由具有高生物相容性的鈣離子交聯(lián)海藻酸鹽制成，融入了經(jīng)過優(yōu)化的T細胞活化試劑（重組人白介素2rhIL-2和抗人CD3/CD28抗體）混合物。大孔徑的海藻酸鹽孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑范圍在20-300 μm之間，無需借助儀器可實現(xiàn)微流體驅(qū)動的慢病毒高效轉(zhuǎn)導。當T細胞和病毒進入轉(zhuǎn)導海綿，T細胞活化劑會激活進入的T細胞，大孔3D結(jié)構(gòu)通過共定位T細胞和病毒促進轉(zhuǎn)導來提高轉(zhuǎn)導效率。轉(zhuǎn)導完成后，使用特定緩沖液溶解海綿，轉(zhuǎn)導后的細胞就會被釋放出來。

Lenti-X T-Cell轉(zhuǎn)導海綿工作原理

將靶標細胞（T細胞或PBMCs）和慢病毒混合后，添加到T細胞轉(zhuǎn)導海綿中，37°C孵育1小時，以使混合物被充分吸收。吸收完全后，加入細胞培養(yǎng)基，37°C孵育48小時。

孵育完成后，加入專用的釋放緩沖液浸泡海綿，轉(zhuǎn)導后的細胞就可以輕松從海綿中釋放出來。在隨后的洗滌步驟中，完成轉(zhuǎn)導的海綿會被溶解，而這不會對細胞活力造成影響。這些細胞可以擴大培養(yǎng)或者用于下游研究應(yīng)用。整個操作過程減少了對細胞的處理步驟，降低了對病毒的需求量，總反應(yīng)體積也更小，對用戶非常友好。使用T細胞轉(zhuǎn)導海綿，可以獲得與傳統(tǒng)方法相當或優(yōu)于傳統(tǒng)方法的轉(zhuǎn)導效率，并且更容易獲得高度一致的實驗結(jié)果，實驗穩(wěn)定性和重復性高。

案例分享1——高效活化人原代T細胞

不同MOI情況下高效活化T細胞。

將表達綠色熒光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染復數(shù)（MOI=0，5，10，Average）和4 × 10⁶人原代T細胞進行混合，分別添加至Lenti-X T細胞轉(zhuǎn)導海綿（" T-cell sponge "）進行活化，同時也使用CD3/CD28 Immunocult T細胞激活劑（"Conjugate"）活化T細胞作為平行比較。未經(jīng)激活處理的細胞作為陰性對照（"Unstim"）。48小時后，通過流式細胞熒光分選技術(shù)（FACS）分析檢測活化T細胞中CD69的表達情況。在本案例中，T細胞轉(zhuǎn)導海綿實驗組CD69陽性率要高于Conjugate實驗組。

案例分享2——高效轉(zhuǎn)導人原代T細胞

不同MOI情況下高效轉(zhuǎn)導人原代T細胞。

將表達綠色熒光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染復數(shù)（MOI=0，5，10）和4 × 10⁶人原代T細胞進行混合，分別添加至Lenti-X T細胞轉(zhuǎn)導海綿（" T-cell sponge "）進行轉(zhuǎn)導。Spinoculated樣品使用CD3/CD28 Immunocult T細胞激活劑活化2天，之后添加polybrene (8 µg/ml)作為轉(zhuǎn)導增強劑同時1,500 g離心90分鐘促進慢病毒轉(zhuǎn)導（"Spinoculation"）。通過流式細胞熒光分選技術(shù)（FACS）分析指定時間點綠色熒光蛋白（GFP）ZsGreen1的表達情況來評估轉(zhuǎn)導效率。圖中顯示的百分比是轉(zhuǎn)導七天時GFP+的表達情況。在本實驗例中，T細胞轉(zhuǎn)導海綿實驗組GFP+陽性率均高于Spinoculation方案實驗組。

案例分享3——轉(zhuǎn)導后依然保持高細胞活力

轉(zhuǎn)導后人原代T細胞依然保持高細胞活力。

將表達綠色熒光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染復數(shù)（MOI=0，5，10）和4 × 10⁶人原代T細胞進行混合，分別添加至Lenti-X T細胞轉(zhuǎn)導海綿（" T-cell sponge "）進行轉(zhuǎn)導。Spinoculated樣品使用CD3/CD28 Immunocult T細胞激活劑活化2天，之后添加polybrene (8 µg/ml)作為轉(zhuǎn)導增強劑同時1,500 g離心90分鐘促進慢病毒轉(zhuǎn)導（"Spinoculation"）。轉(zhuǎn)導后通過7-AAD染色法和流式細胞熒光分選技術(shù)（FACS）在指定時間點對細胞活力進行分析。在本實驗例中，T細胞轉(zhuǎn)導海綿實驗組依然保持較高的細胞活力，與Spinoculation方案實驗組水平相當或者略高。

除了專用于T細胞的轉(zhuǎn)導海綿，Takara Bio還可以提供適用范圍廣譜的通用型轉(zhuǎn)導海綿，可用于轉(zhuǎn)導人原代T細胞、CD34+造血干細胞、自然殺傷細胞、懸浮和貼壁細胞系等細胞類型，使用廣譜不局限，可塑性更強。Takara Bio作為重要的生物技術(shù)企業(yè)，在病毒基因?qū)�入系統(tǒng)方面體系完備，擁有慢病毒系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)、腺相關(guān)病毒系統(tǒng)、腺病毒全套解決方案，為相關(guān)生物學基礎(chǔ)研究提供強力支持，為寄予厚望的細胞與基因治療研究護航加碼。

創(chuàng)新驅(qū)動夢想前行，技術(shù)創(chuàng)新，Takara Bio一直在路上。

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