免疫組庫（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定時間，個體的循環系統內所有功能多樣性B細胞和T細胞的總和。

T細胞是獲得性免疫反應的重要組成部分，其表面受體蛋白（T cell receptors, TCRs）發揮著識別抗原分子的作用。NGS是解析TCR多樣性的主流技術，對揭示個體獲得性免疫反應的奧秘提供了寶貴的技術支撐。

SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)是一款具有高靈敏度和低偏差的小鼠TCR NGS文庫構建試劑盒。該試劑盒整合SMART（Switching Mechanism at 5' end of RNA Template）全長cDNA合成技術與5’RACE技術，可捕獲TRA和TRB基因完整的V(D)J可變區，用于后續NGS分析。

該試劑盒支持使用不同input量的RNA（RIN＞7）或細胞起始，均可獲得高品質的測序文庫，如小鼠脾臟或T細胞來源 total RNA(1 ng-1 μg)，以及全血、骨髓、胸腺來源total RNA(10 ng -1 ug)，或純化后完整的T細胞(1,000-10,000個)。文庫中可同時包含α鏈和β鏈的多樣性信息。

同時，該試劑盒包含UMI（Unique Molecular Identifier），用以去除PCR偏差及測序錯誤所產生的reads，提供更正確和可靠的結果。

搭配使用UDI（Unique Dual Indexs），最多可支持384個樣本同時測序。

特別開發的Cogent NGS Immune Profiler Software (Cogent IP)，能直接對Illumina測序儀的下機數據進行高品質的TCR profiling分析，包括克隆型的鑒定與計數、V(D)J區域的序列分析。另外，基于云的Cogent NGS Immune Viewer，能可視化的展示TCR數據，使用Cogent IP輸出文件，可以輕松生成可供發布的圖表結果。

下面就詳細了解一下它的特點吧！

圖1 SMART-Seq Mouse TCR(with UMIs)技術流程

圖2 評估試劑盒在不同樣本起始量和樣本類型中的性能表現 

Panel A. 分別對10，100，250，500和1,000 ng小鼠脾臟來源 RNA使用SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)制備了TRA (藍色) 和TRB (紫色) 文庫，然后在Illumina NextSeq測序（PE 150），測序reads downsampled至1.5×10⁷。結果顯示，隨著起始量的增加，檢測到的克隆型數量也隨之增加。

Panel B. 分別對四種不同樣品類型的小鼠RNA（200 ng RNA）使用SMART-Seq Mouse TCR制備文庫。然后在Illumina NextSeq測序（PE 150），測序reads downsampled至2.5×10⁷。測序結果表明，TCR序列在這些樣品類型中都被靈敏地檢測到，這表明該試劑盒非常適合用于小鼠TCR的分析。

圖3 使用UMIs校正PCR重復和測序錯誤

Panel A. 對10 ng小鼠脾臟來源 RNA使用SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)制備TRA和TRB文庫。其中藍線和紫線分別是指經過UMI修正誤差和和沒有經過UMI修正誤差的數據。

Panel B. 為了評估SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)的再現性，使用該試劑盒分別對10 ng和100 ng小鼠脾RNA起始樣本構建TCR文庫。然后在Illumina MiSeq測序。維恩圖顯示分別使用300 cycles和600 cycles測序時，兩者之間至少有87%的克隆型重疊，表明該試劑盒卓越的再現性。

圖4 評估試劑盒的測序靈活性 

為了評估該試劑盒是否支持全長V (D) J或CDR3序列，使用該試劑盒分別對10 ng和100 ng小鼠脾臟RNA起始樣本構建TCR文庫。然后在Illumina MiSeq測序平臺使用300 cycles和600 cycles進行測序。測序read downsampled 至1×10⁶。使用Takara Bio Cogent NGS Immune Profiler軟件處理數據。