關(guān)于肽核酸

肽核酸 (Peptide Nucleic Acid，PNA) 是一種人工合成的類似于 DNA 或 RNA的聚合物。與多肽類似，各種嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基連接到主鏈骨架上。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高。不易被DNA酶和蛋白酶水解，PNA在體內(nèi)以及體外極其穩(wěn)定。

PNA的主要應(yīng)用

•  序列特異性的PCR抑制劑（PNA夾）
•  端粒、著絲粒FISH探針，基因特異性探針，感染試驗(yàn)
•  反義/抗微生物試劑
•  miRNA抑制劑
•  雙鏈DNA侵入和捕獲
•  微陣列探針

非標(biāo)記PNA

由于其高親和力和特異性，PNA能有效結(jié)合靶核酸。未標(biāo)記的PNA通常作為基因的PCR反應(yīng)的特異性阻斷劑（PNA夾）。這種技術(shù)可以有效地檢測(cè)靶基因中的SNP突變。

PNA傾向于定向且逆平行結(jié)合到靶核酸。PNA 5' 端的氨基（也寫為 5' 或 H-），可以結(jié)合其它功能基團(tuán)，PNA 3' 端的酰胺基（也寫為-NH2或3'）反應(yīng)活性弱。5' 端乙酰化可以阻止其繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)。

因?yàn)镻NA的解鏈溫度Tm 高于DNA，一般情況下，大部分使用的PNA的長(zhǎng)度為10 ~ 21個(gè)堿基。PNA鏈越長(zhǎng)，溶解性越差。嘌呤含量高（＞60%）尤其是堿基G，是導(dǎo)致溶解性差的原因。根據(jù)序列，PNA鏈最大長(zhǎng)度約為40個(gè)堿基。然而，我們強(qiáng)烈建議檢查Tm，設(shè)計(jì)探針應(yīng)具有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度和序列。

當(dāng)PNA鏈較長(zhǎng)（>22mer）或者嘌呤含量高（＞60%）時(shí)，為了提高PNA探針的溶解性，我們建議在序列中加入一些助溶基團(tuán)如O linker、E linker、X linker或者兩個(gè)賴氨酸。當(dāng)PNA偶聯(lián)多肽或染料時(shí)，接頭(linker)可以起到空間間隔(spacer)的作用。

•  可能用到的接頭

    - O linker (也稱 AEEA 或 eg1)：常用來提高溶解性
    - 起到空間間隔作用：O、E、X、C3、C4、C6、C12
    - 加入巰基：C6SH、C11SH

標(biāo)記PNA

PNA鏈5’端和3’端均可以標(biāo)記。由于3' 端是非活性基團(tuán)(-CONH2)，所以需加入一個(gè)賴氨酸，其側(cè)鏈上的氨基可以用來標(biāo)記。

如果在5' 端標(biāo)記，我們建議在PNA 和標(biāo)記物之間加 1~2 O linkers。

標(biāo)記物：熒光基團(tuán)（—NHS酯或羧基酰胺）、生物素、棕櫚酸、地高辛、DABCYL、疊氮化物、亞甲基藍(lán)、巰基等。

肽核酸-多肽

因?yàn)殡暮怂嶂麈準(zhǔn)腔�于多聚酰胺連接在一起，肽核酸可以很容易地與多肽結(jié)合以增加功能。例如，加入賴氨酸可提高肽核酸的溶解性；加入半胱氨酸可使肽核酸與其它分子通過二硫鍵連接在一起。

PNA鏈兩端均可以用來偶聯(lián)多肽，但經(jīng)常偶聯(lián)在5' 端（肽+ PNA）。多肽和PNA之間需加入起到空間間隔作用的O linker。

肽核酸-多肽一個(gè)最普遍的應(yīng)用就是用作抗微生物試劑，它是由CPP[最常見的（KFF）3K或（RXR）4xB]和含有10 ~ 15堿基的 PNA分子組成，對(duì)微生物必需的基因具有反義作用。

同樣，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，使用CPP-PNA（設(shè)計(jì)的PNA對(duì)靶mRNA反義）可以很容易地建立反義寡核苷酸的方法。最常見的是，PNA設(shè)計(jì)在5' ATG 和上游區(qū)域。

多肽-PNA另一種應(yīng)用是基因芯片，可以從目標(biāo)微生物中捕獲反基因和轉(zhuǎn)錄基因。

一般來說，肽核酸-多肽是在樹脂上從C端到N端連續(xù)合成的。

設(shè)計(jì)PNA

PNA低聚物可以在任一方向形成雙鏈，但反平行方向優(yōu)先。

PNA / DNA的Tm一般比相應(yīng)的DNA / DNA高。粗略地說，每一個(gè)堿基對(duì)可增加大約1℃。

由于和互補(bǔ)DNA 序列高親和性，通常不需要設(shè)計(jì)長(zhǎng)鏈的PNA。最常見的PNA含有12-21個(gè)堿基。

強(qiáng)烈建議避免任何自我互補(bǔ)序列，如反向重復(fù)序列，發(fā)夾和回文序列，這是因?yàn)镻NA / PNA相互作用強(qiáng)于PNA / DNA。

同樣建議避免嘌呤含量高的序列，因?yàn)樗鼈兺�往發(fā)生聚合，導(dǎo)致水溶性差。盡量使嘌呤含量低于60%。也盡量避免相鄰嘌呤超過6個(gè)殘基，特別是連續(xù)4個(gè)或更多的G殘基。

為了提高PNA探針的溶解性，可在序列中加入一些助溶基團(tuán)如O linker、E linker、X linker或者兩個(gè)賴氨酸。

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