表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究范圍

表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)（epitranscriptomics，又稱“RNA表觀遺傳學(xué)”）是指轉(zhuǎn)錄后 RNA 修飾，這些修飾給轉(zhuǎn)錄組帶來了功能相關(guān)的變化。表觀轉(zhuǎn)錄組修飾包括幾個(gè)重要的 RNA 加工事件，包括 RNA 編輯、甲基化和剪接（圖二)。

從是否編碼蛋白質(zhì)來說，RNA可以分為編碼RNA（coding RNA）修飾和非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA）兩大類。前者就是指mRNA，后者則包括很多種類，如眾所周知的tRNA和rRNA，參與RNA修飾的snoRNA等。

mRNA修飾研究最多的就是m6A 修飾，早在 20 世紀(jì) 70 年代，科學(xué)家們就在 RNA 中發(fā)現(xiàn)了 m6A 修飾，隨后越來越多的研究證明m6A 修飾的重要性：m6A 修飾和 mRNA 的穩(wěn)定性、剪接加工、翻譯以及 microRNA 的加工有關(guān)；m6A 還和干細(xì)胞命運(yùn)、生物節(jié)律相關(guān)，可以促使干細(xì)胞從自我更新狀態(tài)轉(zhuǎn)向細(xì)胞分化，研究人員發(fā)現(xiàn)，甲基化會(huì)縮短 mRNA 的半衰期，減少其豐度。可以說，m6A 修飾幾乎影響 RNA 代謝的每個(gè)步驟。

而近年來，隨著研究的深入，不少研究工作也從mRNA轉(zhuǎn)為關(guān)注非編碼RNA的甲基化對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展過程的重要作用，發(fā)現(xiàn)非編碼RNA的m6A甲基化會(huì)在干細(xì)胞分化、癌細(xì)胞增殖等過程中起關(guān)鍵作用。同mRNA一樣，lncRNA上也存在著多種化學(xué)修飾，m6A甲基化對(duì)于lncRNA來講，可以調(diào)控lncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，lncRNA結(jié)合蛋白，以及lncRNA的ceRNA機(jī)制，靶基因的m6A修飾。

此外還有環(huán)狀RNA上m6A修飾，這能影響circRNA和RNA結(jié)合蛋白(RBP)之間的相互作用，以及標(biāo)記內(nèi)源RNA，從而將其與外源RNA區(qū)分開，避免被自身免疫系統(tǒng)識(shí)別攻擊。

Small RNA，例如microRNA，tRNA來源小RNA(tsRNA，包括tRF&tiRNA)等，其RNA分子上具有多種不同的修飾，這些修飾一方面能夠調(diào)控small RNA的活性，另一方面也可以賦予它們新的功能。已知這些RNA修飾通過多種分子機(jī)制來發(fā)揮功能，如RNA修飾可以改變miRNA的靶向性或改變tsRNA(tRF&tiRNA)與RNA結(jié)合蛋白的親和力，進(jìn)而發(fā)揮生物活性等。Small RNA修飾譜分析是表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的新前沿，具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

RNA 修飾領(lǐng)域最重要的成就

對(duì)于迄今為止RNA修飾領(lǐng)域最重要的成就，康奈爾大學(xué)Samie R. Jaffrey教授認(rèn)為，“第一個(gè)用于繪制 m6A全轉(zhuǎn)錄組方法可能是表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域中最重要的事件，現(xiàn)在已經(jīng)被復(fù)制用于其他幾種核苷酸修飾。 在全轉(zhuǎn)錄組作圖之前，通過使用質(zhì)譜法或其他分析測量檢測水解 RNA 中修飾的核苷酸，發(fā)現(xiàn)修飾的核苷酸。這些方法是模棱兩可的，尤其是對(duì)于低豐度的修飾：即使你有一個(gè)高純度的 mRNA 制劑，你還是擔(dān)心微量的污染轉(zhuǎn)移 RNA (tRNA) 或核糖體 RNA (rRNA) 可能是修飾的來源。這使得很難確定修飾的核苷酸是否來自 mRNA。”

以色列特拉維夫大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Gideon Rechavi教授則表示，“在我看來，該領(lǐng)域的主要成就是通過mRNA 修飾揭示了一個(gè)新的、復(fù)雜的、高度敏感的、可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)調(diào)控層。這一新的調(diào)控層利用了mRNA 的獨(dú)特特性——即它是短暫的、高度結(jié)構(gòu)化的、在細(xì)胞區(qū)室之間移動(dòng)并通過轉(zhuǎn)錄放大的。這些影響部分是由“閱讀器”介導(dǎo)的，例如甲基特異性結(jié)合蛋白，它的鑒定是修飾領(lǐng)域的一個(gè)里程碑。基因表達(dá)的調(diào)節(jié)也通過“寫手”和“橡皮擦”的修改安裝和刪除之間的相互作用進(jìn)行調(diào)整。在過去的十年中，出現(xiàn)了幾個(gè)重要的教訓(xùn)。首先，mRNA 修飾非常普遍，數(shù)千個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本被修飾。有趣的是，一些修改聚集在特定的轉(zhuǎn)錄位置；例如，肌苷主要存在于重復(fù)的 Alu 序​​列中，m6A 優(yōu)先修飾終止密碼子附近和內(nèi)部外顯子、 AUG 起始密碼子周圍的 m1A 簇，這表明每個(gè)修飾通過不同的模式起作用行動(dòng)。此外，一些修飾，如 m6A 和 m1A，在人和小鼠之間表現(xiàn)出高度的保守性。

另一個(gè)重要的成就是發(fā)現(xiàn)特定的修改可以通過不同的行為模式，通過不同的讀取，依賴于上下游。還有一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是一些 mRNA 修飾的動(dòng)態(tài)特性，可以對(duì)環(huán)境刺激做出快速反應(yīng)； m6A 和 m1A 已經(jīng)證明了這種動(dòng)態(tài)特性。 mRNA 修飾的核心作用體現(xiàn)在異常修飾對(duì)人類和小鼠早期發(fā)育以及人類癌癥、炎癥和神經(jīng)變性的破壞性影響，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了這一調(diào)節(jié)層的重要性。”

東京大學(xué)的Tsutomu Suzuki教授表示，“以前關(guān)于 RNA 修飾的生化研究主要集中在經(jīng)典的非編碼 RNA，包括 tRNA、rRNA 和小核 RNA (snRNA)，因?yàn)檫@些RNA 在細(xì)胞中含量豐富。然而，最近，使用 NGS 技術(shù)對(duì) RNA修飾進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析已定出幾種堿基修飾，包括 mRNA 中的肌苷 (I)、m6A、m5C、Ψ 和 m1A 以及長鏈非編碼 RNA。這反過來這大大拓寬了表觀轉(zhuǎn)錄組的概念。

在過去的十幾年中，通過反向遺傳學(xué)和質(zhì)譜法，科學(xué)家們識(shí)別出了埋藏在模式生物基因組中的RNA 修飾酶。使用這種方法，我們成功鑒定了 40 個(gè)RNA 修飾基因。

還值得一提的是，與疾病相關(guān)的外顯子組測序有助于解析RNA 修飾酶突變?nèi)绾我�發(fā)了許多人類疾病。”[5]

如何研究RNA修飾

從目前的研究成果來看，表觀轉(zhuǎn)錄組影響深遠(yuǎn)，是作為將可塑性疊加在其他基因組上連線轉(zhuǎn)錄組上的一種手段。表觀轉(zhuǎn)錄組“代碼”不僅可以啟用或增強(qiáng) RNA 催化或 RNA 依賴性反應(yīng)中的特定化學(xué)反應(yīng)，還可以改變 RNA 結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，從而以時(shí)空和信號(hào)依賴性方式提供額外的基因調(diào)控層。

然而，表觀轉(zhuǎn)錄組的功能研究落后于表觀基因組的功能研究，這是因?yàn)槿狈�可以在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測這些表觀轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記的靈敏且穩(wěn)健的技術(shù)。研究表觀轉(zhuǎn)錄組存在幾個(gè)主要挑戰(zhàn)。首先，大多數(shù) RNA 修飾不能通過高通量測序直接檢測到。因?yàn)閷?duì) RNA 的化學(xué)修飾通常不會(huì)改變修飾堿基的堿基配對(duì)特性，逆轉(zhuǎn)錄 (RT) 將簡單地擦除這些修飾，并使它們與常規(guī) RNA 堿基無法區(qū)分。其次，雖然 rRNA、tRNA 和 snRNA 很豐富，但其他類型的RNA，例如 mRNA 和長鏈非編碼 RNA (lncRNA)，豐度可能較低。第三，缺乏現(xiàn)有的計(jì)算工具來促進(jìn)從測序數(shù)據(jù)識(shí)別修飾位點(diǎn)的能力。

幸運(yùn)的是，近年來，針對(duì)不同表觀轉(zhuǎn)錄組的研究方法取得了重大進(jìn)展。這些新工具幫助研究人員確定 RNA 修飾的位置，并揭示這些修飾在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的不同分布模式。當(dāng)這些方法與其他新興工具（例如基因組編輯工具）結(jié)合使用時(shí)，RNA 修飾酶的靶標(biāo)就已確定。此外，這些技術(shù)還揭示了不同生理?xiàng)l件下不同表觀轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。同時(shí)這些工具使人們能夠發(fā)現(xiàn)選擇性識(shí)別特定表觀轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記并確定其功能的“閱讀器”蛋白。因此，新的研究工具不僅可以對(duì)表觀轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析，而且還是功能表觀轉(zhuǎn)錄組研究的寶貴資源 [2]。

⑴  檢測分析方法

研究 RNA 修飾的方法包括是液相色譜(LC-MS) 、基于高通量測序的方法和芯片分析等方法。

①    mRNA&lncRNA表觀轉(zhuǎn)錄組芯片

RNA修飾的潛在功能不僅取決于其所修飾的是何種基因轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)也取決于被修飾部分在該轉(zhuǎn)錄本中所占的百分比。然而，目前大部分轉(zhuǎn)錄組水平的的RNA修飾檢測方法著重于尋找轉(zhuǎn)錄本上的修飾位點(diǎn)，不能夠定量地檢測被修飾轉(zhuǎn)錄本的百分比。這一類定量信息的缺乏已引起越來越多科研工作者的關(guān)注。

mRNA修飾的潛在影響既取決于其分子效應(yīng)，也取決于被修飾轉(zhuǎn)錄本的百分比。例如，一種可以加速mRNA降解的修飾，如果只有1%的轉(zhuǎn)錄本被修飾，顯然不太可能產(chǎn)生任何生物功能，然而當(dāng)一種修飾可以促使mRNA翻譯成新的蛋白亞型時(shí)，即使修飾水平很低，也可能產(chǎn)生重要的生物功能。當(dāng)前的m6A和Ψ檢測方法局限性在于缺乏修飾程度的定量信息。m6A的調(diào)控作用可以通過pulldown m6A的方法，檢測特定序列在不同狀態(tài)下的相對(duì)富集程度進(jìn)行推斷，但不能從這些數(shù)據(jù)中獲得被修飾mRNA的絕對(duì)量。新的可定量m6A和Ψ的高通量檢測方法，將極大的促進(jìn)該領(lǐng)域的發(fā)展[7]。

另一個(gè)重要的問題是闡明RNA修飾的化學(xué)計(jì)量的動(dòng)態(tài)變化。目前，表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重點(diǎn)大多是哪些位點(diǎn)被修飾，而不是RNA中每個(gè)被修飾位點(diǎn)的占比。低通量分析mRNA和病毒RNA的m6A修飾位點(diǎn)顯示，任何m6A修飾位點(diǎn)的占比都不會(huì)達(dá)到100%。修飾的化學(xué)計(jì)量變化可能是一種RNA生物學(xué)修飾的動(dòng)態(tài)變化參數(shù)。修飾可以影響mRNA的結(jié)構(gòu)，和（或）對(duì)RBPs的招募。任何特殊位點(diǎn)的修飾，會(huì)導(dǎo)致同一mRNA群體僅僅由于結(jié)構(gòu)或是結(jié)合reader的不同，分為兩個(gè)mRNA亞群。因此，改變修飾的化學(xué)計(jì)量數(shù)，可能是同一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本行使不同功能的一種機(jī)制。目前急需可以檢測修飾化學(xué)計(jì)量數(shù)的高通量方法，以闡明表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)在這一方面的問題[8]。

Arraystar mRNA&lncRNA表觀觀轉(zhuǎn)錄組芯片結(jié)合了雙熒光通道芯片技術(shù)與RNA修飾免疫共沉淀技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄本水平對(duì)RNA修飾進(jìn)行定量檢測。定量的表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜可為RNA修飾調(diào)控研究提供重要信息。

此外，還有Arraystar small RNA修飾芯片，康成提供的相關(guān)技術(shù)服務(wù)在單張芯片可定量miRNA，pre-miRNA和tRNA衍生的small RNA（tsRNA，包括tRF＆tiRNA）的堿基修飾。可檢測的修飾包括：8-氧代鳥嘌呤（o8G），7-甲基鳥苷（m7G），N6-甲基腺苷（m6A），假尿苷（Ψ）或5-甲基胞苷（m5C）。

索取康成生物Arraystar 表觀轉(zhuǎn)錄組芯片

②液相色譜-質(zhì)譜法

LC-MS 是一種強(qiáng)大的技術(shù)，能以出色的靈敏度和高特異性檢測修飾過的RNA核苷。然而，在測量 mRNA 修飾的背景下，有兩個(gè)關(guān)鍵限制。

首先，LC-MS 進(jìn)行位點(diǎn)特定檢測的能力有限。在 mRNA 的背景下，迄今為止，MS 僅適用于完全消化的核苷，因此能夠估計(jì)樣品中修飾的“整體”水平，但排除了將該修飾分配到單個(gè)位點(diǎn)的可能性。當(dāng)應(yīng)用于部分消化的 RNA 寡核苷酸時(shí)，LC-MS 原則上還可以提供位點(diǎn)特定信息。然而，這種分析通常需要數(shù)十到數(shù)百納克的至少部分純化的分子，這對(duì)于 mRNA 來說是不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)樗�具有高度異質(zhì)性和低豐度 的特性。

其次，與 tRNA 和 rRNA 相比，mRNA 中修飾的相對(duì)水平越低，因此解釋 LC-MS 結(jié)果變得越來越困難。即使來自高度表達(dá)的 tRNA 和 rRNA 的低水平污染（永遠(yuǎn)無法完全避免，盡管它們可以在一定程度上基于 tRNA 特異性或 rRNA 特異性核苷進(jìn)行估計(jì)），也可能導(dǎo)致對(duì)mRNA修飾水平的高估。m6A 是 MS 廣泛進(jìn)行的第一個(gè)mRNA 修飾分析，在這方面施加的限制較少，因?yàn)樗��?SPAN lang=EN-US> mRNA 中高度豐富，但在 tRNA 中不存在，并且僅存在于 rRNA 中的兩個(gè)位點(diǎn)（因此，污染可能導(dǎo)致低估實(shí)際 m6A 水平）。

相比之下，絕大多數(shù)非 m6A 表觀轉(zhuǎn)錄組在 mRNA 中都非常罕見，在 tRNA 和 rRNA1 中更為普遍，這嚴(yán)重限制了 LC-MS 了解其豐度和動(dòng)態(tài)的能力。在一些情況下，通過 LC-MS 估計(jì)的修飾豐度（基于該修飾被認(rèn)為在 mRNA 中以高水平存在）和基于基因組方法（通常無法檢測 mRNA 中的大量修飾）；因此，這些差異的根源可能在于 mRNA 部分中的 tRNA 或 rRNA 污染物。另一種可能性是某些修飾是 RNA 損傷的結(jié)果，這可能導(dǎo)致核苷酸的烷基化和氧化。這種隨機(jī)散布在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的非酶促修飾可以通過 LC-MS 檢測到，但不能通過基因組方法檢測到，這需要在特定位點(diǎn)積累信號(hào)。

③基于測序的方法

在過去十年中，基于高通量測序分析各種修飾已經(jīng)成為了該領(lǐng)域進(jìn)步的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力。這些方法可以告知 mRNA 中修飾的存在及其在轉(zhuǎn)錄組中的精確位置。

與 LC-MS 相比，原則上單個(gè)工作流程就可以獲知所有修飾的豐度，而使用基因組方法識(shí)別修飾需要為每個(gè)修飾開發(fā)專用且獨(dú)特的工作流程。這種方法需要克服的根本挑戰(zhàn)是，大多數(shù)修飾在標(biāo)準(zhǔn)測序中是“不可見的”，也就是說，它們?cè)趯?SPAN lang=EN-US> RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后不會(huì)留下任何痕跡，這是基于 Illumina 的標(biāo)準(zhǔn)測序的先決步驟方法。因此，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)了一套方法來呈現(xiàn)不同的可見修改。對(duì)于 m6A，主要檢測方法依賴于抗 m6A 抗體，這些抗體用于選擇性免疫沉淀含有 m6A 的短 RNA 片段。

盡管免疫沉淀是一種通用方法，原則上可以用于檢測任何修飾，但實(shí)際上，基于抗體的方法在繪制非 m6A 表觀轉(zhuǎn)錄組的圖譜方面的效用相當(dāng)有限。曾經(jīng)研究人員嘗試使用它來繪制 m1A 或 ac4C36 的圖譜，現(xiàn)在被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致大量假陽性位點(diǎn)，這可能是由于抗體交叉反應(yīng)造成的。抗 m6A 抗體也存在這種交叉反應(yīng)性；然而，鑒于 m6A 的豐度相對(duì)較高，信噪比仍然可控。相比之下，以較低數(shù)量級(jí)的豐度存在的修飾導(dǎo)致非特異性與特異性結(jié)合事件的比率急劇增加。

因此，對(duì)于絕大多數(shù)非 m6A 表觀轉(zhuǎn)錄組，已經(jīng)開發(fā)出利用修飾堿基的獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)使它們?cè)谀孓D(zhuǎn)錄后可見的方法。這是通過不同的策略實(shí)現(xiàn)的，例如，通過改變修飾堿基身份的修飾特異性化學(xué)物質(zhì)或通過將大量殘基特定連接到修飾堿基上導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄過程中過早截?cái)啵ㄒ娤卤恚�。這些實(shí)驗(yàn)方案通常會(huì)導(dǎo)致修改位點(diǎn)的錯(cuò)配或缺失，或者導(dǎo)致讀取的“堆積”，這些讀取選擇性地在特定位置開始或結(jié)束，然后可以從中推斷出修改的存在。此類化學(xué)基因組學(xué)方法的主要優(yōu)勢在于其出色的、通常為單核苷酸的分辨率，以及它們能夠提供修飾水平的相對(duì)定量，有時(shí)甚至是絕對(duì)定量[1]。

比如康成生物建立了一種高靈敏的絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量分析方法，可以在單核苷酸分辨率水平上準(zhǔn)確檢測RNA中m6A修飾位點(diǎn), 并對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。該方法可成功地應(yīng)用于實(shí)際生物樣品中m6A修飾的精確檢測，即使是低豐度RNA的樣本。

索取康成Arraystar m6A單堿基分辨率芯片技術(shù)資料>>

近年來也有一些新的測序技術(shù)陸續(xù)出現(xiàn)，比如2017 年，北京大學(xué)伊成器課題組和以色列魏茨曼研究所的研究團(tuán)隊(duì)分別獨(dú)立報(bào)道了單堿基分辨率水平檢測 m1A 的新方法——m1A-MAP 和m1A-Seq。2019 年，芝加哥大學(xué) Bryan C． Dickinson 團(tuán)隊(duì)與何川團(tuán)隊(duì)合作，研究開發(fā)了可快速選擇逆轉(zhuǎn)錄酶的進(jìn)化平臺(tái)，并利用該平臺(tái)研究 mRNA 上的 m1A 修飾，實(shí)現(xiàn)了單堿基水平 m1A 的檢測。

另外，直接的RNA納米孔測序也備受關(guān)注，RNA表觀遺傳學(xué)的先驅(qū)人物、康奈爾大學(xué)的Christopher Mason表示，“過去，我們通常是利用抗體或化學(xué)分析來推斷RNA的修飾狀態(tài)。直到最近，我們才開始進(jìn)行直接的RNA測序。利用納米孔測序儀，我們能夠直接測序RNA，而不需要逆轉(zhuǎn)錄。我們第一次直接測定RNA修飾：整個(gè)分子存在哪些修飾，又存在哪些異構(gòu)體。”

所以可以說，納米孔測序能完整測序，讀出RNA序列的m6A,m5C修飾（一般是讀取單分子序列時(shí)比無修飾堿基有延遲），讀長優(yōu)勢使之對(duì)可變剪切研究和異構(gòu)體更有優(yōu)勢，不用拼接，也不容易丟失罕見分子，但是就是費(fèi)用比較貴。

在最近的一篇熱點(diǎn)文章“The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome SARS-CoV-2”中，研究人員就用MinION納米孔測序儀進(jìn)行了DRS測序，獲得了879,679個(gè)reads（1.9 Gb），結(jié)果不僅證明了病毒轉(zhuǎn)錄本占據(jù)主導(dǎo)地位，而且納米孔DRS基于RNA的單分子檢測，提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)來檢查單個(gè)RNA分子的多個(gè)轉(zhuǎn)錄組特征，解析了新冠病毒RNA修飾特點(diǎn)[9]。

⑵目前已知的RNA表觀轉(zhuǎn)錄修飾：

m6A

m6A是真核生物mRNA上含量最豐富的化學(xué)修飾，由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（包含METTL3，METTL14，WTAP，KIAA1429，RBM15，RBM15B）催化產(chǎn)生，可被去甲基化酶ALKBH5或FTO去除。目前已發(fā)現(xiàn)了多種特異性識(shí)別m6A位點(diǎn)的蛋白或復(fù)合物，包括YTH家族蛋白（YTHDF1-3，YTHDC1）、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物eIF3、核糖核蛋白（HNRNPA2B1，HNRNPC）以及RNA結(jié)合蛋白SRSF2。m6A主要分布在終止密碼子附近和3’UTR區(qū)，影響RNA配對(duì)、改變RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、或被蛋白直接識(shí)別，進(jìn)而調(diào)控mRNA的成熟、可變剪接、穩(wěn)定性和翻譯過程。與A-U配對(duì)相比，m6A-U配對(duì)較不穩(wěn)定，引發(fā)RNA內(nèi)部雙鏈解旋與二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。m6A常在雙鏈與單鏈的過渡區(qū)域堆疊，增強(qiáng)RNA轉(zhuǎn)變后構(gòu)象的穩(wěn)定性。去甲基化則可以使mRNA恢復(fù)原來構(gòu)象。這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變可能導(dǎo)致mRNA與不同蛋白的相互作用改變，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。m6A能直接被特定蛋白的疏水結(jié)構(gòu)域所識(shí)別。比如，YTH家族蛋白可以特異性的識(shí)別m6A，特別是GGm6ACU保守序列。其成員之一YTHDC1識(shí)別并結(jié)合m6A，調(diào)控靶向mRNA的可變剪接。而另一成員YRHDF2與m6A結(jié)合后，招募CCR4-NOT復(fù)合物，促進(jìn)靶向RNA的降解。在UV輻射或熱休克反應(yīng)中，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物eIF3與5’UTR區(qū)的m6A結(jié)合，促進(jìn)帽非依賴的翻譯過程。編碼區(qū)的m6A可被SRSF2識(shí)別，參與脂肪生成的調(diào)控。在果蠅中，YTHDC1同源蛋白識(shí)別性別致死mRNA上的m6A位點(diǎn)，調(diào)控其可變剪接，從而控制果蠅的性別。如前所述，m6A介導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)也對(duì)干細(xì)胞分化與生物節(jié)律時(shí)鐘控制十分重要。此外，m6A也能通過影響mRNA與tRNA反密碼子的配對(duì)速率與保真度，從而影響翻譯延伸。

研究方法方面，Arraystar m6A單堿基分辨率芯片利用RNA酶MazF對(duì)m6A敏感的特性，可在單堿基分辨率水平定位m6A位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行定量。該芯片具有其它現(xiàn)存技術(shù)難以企及的優(yōu)勢，是研究m6A動(dòng)態(tài)變化、生物學(xué)功能以及疾病相關(guān)性的強(qiáng)大工具。

m1A

m1A是新近發(fā)現(xiàn)的可逆的表觀轉(zhuǎn)錄修飾，能被RNA修復(fù)酶ALKBH3去除，目前尚未發(fā)現(xiàn)明確的m1A修飾酶與修飾識(shí)別蛋白。與m6A不同，m1A的表達(dá)豐度較低，主要分布在mRNA的5’UTR區(qū)，可能參與調(diào)節(jié)翻譯起始過程。m1A能完全阻止Watson-Crick配對(duì)，引起RNA雙鏈解旋，并促進(jìn)RNA-蛋白的靜電相互作用或RNA可變二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。m1A的生物學(xué)功能仍屬未知。有研究發(fā)現(xiàn)，在熱休克或營養(yǎng)匱乏等壓力條件下，細(xì)胞內(nèi)的m1A表達(dá)水平上升，可能是通過促進(jìn)帽依賴性翻譯，參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。

m5C與hm5C

m5C廣泛分布于tRNA與rRNA上，具有穩(wěn)定tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、影響反密碼子環(huán)構(gòu)象、維持rRNA翻譯保真等功能。新近的RNA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mRNA的編碼區(qū)與非編碼區(qū)上存在8000多個(gè)m5C位點(diǎn)，而且相當(dāng)一部分位點(diǎn)集中在5’UTR與3’UTR區(qū)。m5C可由甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2或TRDMT1催化形成，被雙加氧酶TET氧化形成hm5C。hm5C可能經(jīng)過進(jìn)一步氧化形成f5C，進(jìn)而變回胞嘧啶核苷（C）。m5C不影響堿基配對(duì)，但可能增強(qiáng)堿基堆疊以及RNA與蛋白的疏水作用。m5C具有多種生物學(xué)功能。p16 mRNA在被NSUN2酶添加m5C修飾后，其降解被抑制，穩(wěn)定性增強(qiáng)。在細(xì)胞周期中，NSUN2的表達(dá)受到精密調(diào)控。NSUN2可在CDK1 3’UTR區(qū)添加m5C修飾，促進(jìn)其翻譯；同時(shí)在CDKN1B的5’UTR區(qū)添加m5C修飾，抑制CDKN1B的翻譯。二者共同作用，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。m5C還與衰老相關(guān)基因的翻譯控制有關(guān)，過表達(dá)NSUN2可以延緩復(fù)制性衰老的發(fā)生。作為m5C的氧化產(chǎn)物，hm5C也能增強(qiáng)翻譯效率。hm5C在果蠅的腦中表達(dá)量很高，可能參與果蠅的腦部發(fā)育。

Pseudouridine (ψ)

假尿嘧啶核苷ψ，常被成為第五類核苷酸，由尿嘧啶核苷（U）異構(gòu)化形成。在人的細(xì)胞和小鼠組織的mRNA中，ψ/U的比率約為0.2-0.6%。尿嘧啶與假尿嘧啶的異構(gòu)化反應(yīng)由PUS酶單獨(dú)，或與H/ACA核糖核蛋白一起，催化完成。假尿嘧啶能減少RNA構(gòu)象的可變性，增強(qiáng)堿基配對(duì)穩(wěn)定性以及與蛋白之間的的極性相互作用。假尿嘧啶可能調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和基因表達(dá)，參與酵母的熱休克反應(yīng)，但具體機(jī)制目前尚不明確。

Inosine (I)

肌苷修飾，常稱為A-to-I編輯，是高等真核生物里最常見的一種RNA編輯方式，由腺苷酸脫氨酶ADAR完成。A-to-I編輯主要發(fā)生在非編碼區(qū)或內(nèi)含子區(qū)的Alu元素內(nèi)。A-to-I編輯完全改變了堿基配對(duì)特性，AU配對(duì)轉(zhuǎn)變?yōu)?SPAN lang=EN-US>IC配對(duì)，從而改變所編碼的氨基酸。比如，A-to-I編輯將大腦谷氨酸受體中的谷氨酰胺重編碼為精氨酸，導(dǎo)致了鈣離子通透性的改變。此外，A-to-I編輯還具有改變可變剪接、調(diào)節(jié)miRNA的產(chǎn)生與功能、以及監(jiān)控先天性免疫反應(yīng)等作用。

ac4C

2018年，美國NIH的Shalini Oberdoerffer教授在Cell發(fā)表研究論文：Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency，首次揭示mRNA上存在大量ac4C修飾，并且ac4C影響mRNA的穩(wěn)定性與翻譯效率。

N4-acetylcytidine (ac4C)，N4位乙酰胞嘧啶，是真核原核生物中保守的化學(xué)修飾，早期研究認(rèn)為ac4C主要存在tRNA和18S rRNA上。而近期研究顯示，mRNA上也存在大量的ac4C，其豐度甚至不低于mRNA攜帶的m7G帽子修飾。NAT10是目前鑒定的唯一同時(shí)具有乙酰化酶結(jié)構(gòu)域和RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，因此被認(rèn)為是RNA ac4C修飾酶。

由此，乙酰化作為一類新的 mRNA 修飾，將表觀轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)展到已知類別的甲基化和異構(gòu)化之外。這些工作還擴(kuò)展了 mRNA 修飾的已知庫，并確定了多種化學(xué)修飾的存在，mRNA 修飾的新模式在未來很可能會(huì)繼續(xù)出現(xiàn)。進(jìn)一步了解這些修飾的功能、調(diào)節(jié)它們?cè)谔囟ㄞD(zhuǎn)錄本上的存在的途徑和機(jī)制，以及它們?cè)诟鞣N生理和疾病背景下的功能，將有助于更全面地了解表觀轉(zhuǎn)錄組在基因表達(dá)中的作用[6]。

TGM修飾

5’端超甲基化的TMG修飾是最早被發(fā)現(xiàn)的修飾之一。在許多被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的RNA中，尤其是非編碼RNA，例如剪接體的重要組成成分snRNA，5’端的m7G甲基帽子會(huì)被超甲基化，形成具有三個(gè)甲基的N2, N2, 7-三甲基鳥苷（TMG）帽子，廣泛存在于真核生物中。三甲基鳥苷合成酶（Tgs1）在許多生物體中已經(jīng)被證實(shí)是合成TMG帽子的唯一甲基酶，在進(jìn)化上從酵母到人類都很保守。由于體外實(shí)驗(yàn)的局限性，TMG修飾對(duì)剪接體RNA的調(diào)控機(jī)制還存在很多不清楚的地方，并且在大多數(shù)多細(xì)胞模式生物中都無法直接從體內(nèi)對(duì)TMG修飾進(jìn)行研究，因此，TMG修飾已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了五十多年，但是其在多細(xì)胞生物中的功能并不明確。

 （生物通：萬紋）

參考文獻(xiàn)：

1. The epitranscriptome beyond m6A,Nature Reviews Genetics volume 22, pages119–131 (2021)

2. Epitranscriptome sequencing technologies: decoding RNA modifications,Nature Methods volume 14, pages23–31 (2017)

3. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate,Nature Reviews Genetics volume 18, pages275–291 (2017)

4. RNA editing-dependent epitranscriptome diversity in cancer stem cells,Nature Reviews Cancer volume 17, pages381–392 (2017)

5. RNA modifications: what have we learned and where are we headed? Nature Reviews Genetics volume 17, pages365–372 (2016)

6. mRNA acetylation: a new addition to the epitranscriptome，P. Cody He & Chuan He Cell Research volume 29, pages91–92 (2019)

7. Wendy V. Gilbert, Tristan A. Bell, Cassandra Schaening. Science (2016)

8. Cole J.T. Lewis, Tao Pan, Auinash Kalsotra. Nat Rev Mol Cell Biol (2017)

9. The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome,Cell,April 23，2020