植物基因組內(nèi)存在一類由基因反義鏈轉(zhuǎn)錄、與編碼RNA（mRNA）反向互補(bǔ)的非編碼RNA，稱作天然反義RNA（Natural antisense transcripts, NATs）。研究顯示，反義轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象在大部分基因組內(nèi)普遍存在，可與靶基因RNA序列反向互補(bǔ)，以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式干擾編碼和非編碼基因的表達(dá)和功能。同時(shí)，由它產(chǎn)生的RNA干擾作用是植物抗逆基因沉默或低水平表達(dá)的一個(gè)重要原因。除此之外，還參與RNA編輯、內(nèi)含子不規(guī)則剪切、DNA和組蛋白甲基化和基因組印記(Genome imprinting)等生物化學(xué)過程和遺傳現(xiàn)象。

在自然界中許多高等植物需要通過冬季的低溫階段實(shí)現(xiàn)從營養(yǎng)生長到生殖生長的時(shí)期轉(zhuǎn)化, 這一生物學(xué)過程稱作春化作用。FLOWERING LOCUS C(FLC)作為一種重要的開花抑制蛋白負(fù)調(diào)控春化作用，參與植株從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)化過程。

COOLAIR是植物體內(nèi)天然存在的FLC反義轉(zhuǎn)錄本，擬南芥COOLAIR是具有典型的 5’帽子和3’POLY A結(jié)構(gòu)的非編碼RNA。根據(jù)剪切方式的不同，COOLAIR又分為近端（ClassⅠ）和遠(yuǎn)端（ClassⅡ）兩種類型。其中，COOLAIR ClassⅡ的遠(yuǎn)端外顯子延伸至正向轉(zhuǎn)錄本的**個(gè)外顯子和啟動(dòng)子區(qū)域，是典型的植物長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）。

研究發(fā)現(xiàn)，春化作用早期，F(xiàn)LC反義轉(zhuǎn)錄本COOLAIR LncRNA的表達(dá)量會(huì)在低溫脅迫下迅速上調(diào)，相反，F(xiàn)LC mRNA表達(dá)量下調(diào)。為了探究COOLAIR LncRNA在擬南芥FLC低溫誘導(dǎo)的表觀沉默過程中起到怎樣的調(diào)控作用，英國諾里奇研究所Stefanie Rosa研究團(tuán)隊(duì)利用LGC Biosearch公司的單分子熒光原位雜交技術(shù)（Stellaris™ Single-molecule RNA FISH，后面簡稱Stellaris smFISH）對(duì)FLC正義轉(zhuǎn)錄本和反義轉(zhuǎn)錄本COOLAIR在細(xì)胞水平進(jìn)行了亞細(xì)胞時(shí)空定位。

作者發(fā)現(xiàn)，在受到低溫脅迫時(shí)，多數(shù)情況下FLC正義轉(zhuǎn)錄本和反義轉(zhuǎn)錄本不會(huì)出現(xiàn)在同一細(xì)胞中，即便進(jìn)入同一細(xì)胞，F(xiàn)LC和COOLAIR也會(huì)在空間定位上相互排斥（圖1）。通過Stellaris smFISH技術(shù)，作者發(fā)現(xiàn)低溫脅迫前4周，F(xiàn)LC成熟mRNA（主要定位在細(xì)胞質(zhì)）熒光點(diǎn)逐漸減少，而前體mRNA（定位在細(xì)胞核）熒光點(diǎn)則在低溫脅迫2周后消失，因此作者推斷FLC mRNA的轉(zhuǎn)錄在春化作用早期就會(huì)關(guān)閉（圖2）。同時(shí)，COOLAIR的轉(zhuǎn)錄則在前2周被激活，多數(shù)細(xì)胞COOLAIR轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，且在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近聚集成云狀（圖3），通過互斥關(guān)系促進(jìn)FLC正義轉(zhuǎn)錄的順式關(guān)閉，再進(jìn)一步通過改變H3K36me3組蛋白修飾（H3甲基化）動(dòng)力學(xué)影響FLC基因轉(zhuǎn)錄（圖4）。

該文的重要意義在于首次利用Stellaris單分子熒光原位雜交技術(shù)從單細(xì)胞水平揭示了植物FLC基因正義轉(zhuǎn)錄和反義轉(zhuǎn)錄會(huì)在空間定位上相互排斥，證明了COOLAIR LncRNA在植物春化作用表觀遺傳沉默過程中發(fā)揮的作用，同時(shí)，建立了一項(xiàng)切實(shí)有效的方法來原位檢測擬南芥中單個(gè)RNA分子的定位和定量。

盡管RNA熒光原位雜交在許多模式生物中都取得了不錯(cuò)的效果，但是受樣本特殊性以及體內(nèi)自發(fā)熒光的限制，研究植物RNA分子單細(xì)胞之間的異質(zhì)性和亞細(xì)胞定位一直以來都是一個(gè)瓶頸。Stellaris smFISH是一項(xiàng)能夠同時(shí)對(duì)單個(gè)RNA分子進(jìn)行定位、定量和檢測的新型原位雜交技術(shù)，除了觀察RNA定位情況，還非常適合于分析基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)活性、RNA-蛋白互作，以及RNA的轉(zhuǎn)位和遷移，除了應(yīng)用在人、小鼠、果蠅、斑馬魚、酵母、線蟲、病毒等常規(guī)模式生物上，Stefanie Rosa的研究證明該技術(shù)對(duì)植物模式生物擬南芥也同樣適用，同時(shí)她相信，只要對(duì)前期樣本處理進(jìn)行一定優(yōu)化，應(yīng)用于其它植物也不是問題，而植物綠色組織自發(fā)熒光的問題可以借鑒其它物種上的成功經(jīng)驗(yàn)，通過Tissue Clearing和冷凍切片進(jìn)行克服。Stefanie聲稱，這項(xiàng)成果無疑為植物基因調(diào)控研究增加了新的強(qiáng)有力工具！

圖4：COOLAIR促進(jìn)FLC正義轉(zhuǎn)錄的關(guān)閉及COOLAIR調(diào)控植物春化作用機(jī)制原理圖

隨著近年來編碼RNA/非編碼RNA研究進(jìn)展迅猛，以及高水平雜志對(duì)數(shù)據(jù)準(zhǔn)備性的要求越來越高，要確定前期篩選靶標(biāo)的表達(dá)量、分子功能及作用機(jī)制，必須經(jīng)過原位的驗(yàn)證。對(duì)靶基因進(jìn)行組織學(xué)水平或者細(xì)胞學(xué)水平的單分子RNA 原位雜交可以實(shí)現(xiàn)對(duì)研究對(duì)象的精準(zhǔn)原位定量。除了是傳統(tǒng)蛋白水平IHC/IF和DNA 水平DNA FISH原位驗(yàn)證的有力補(bǔ)充，Stellaris RNA FISH由于不受抗體的限制，在植物及微生物研究領(lǐng)域也有著獨(dú)特的優(yōu)勢，且對(duì)于時(shí)下熱門的lncRNA、miRNA、cirRNA等不表達(dá)蛋白的非編碼RNA，也是絕佳的選擇。Stellaris smFISH技術(shù)自發(fā)明以來，以操作簡單、靈敏度高、特異性好且適用性廣而著稱，同時(shí)非常適合于多重RNA共定位，以及RNA-蛋白共定位。這項(xiàng)研究的共同作者Susan Duncan表示，她非常喜歡這項(xiàng)技術(shù)，因?yàn)樗�可以確切了解RNA的位置。“這非常直接。”她說，“實(shí)際上，這就是眼見為實(shí)。”

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參考文獻(xiàn)：
【1】 Rosa S, et al. Mutually exclusive sense–antisense transcription at FLC facilitates environmentally induced gene repression. Nature Communications. 2016.
【2】 Duncan S, et al. A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 2016.
【3】 Csorba, T, et al. Antisense COOLAIR mediates the coordinated switching of chromatin states at FLC during vernalization. PNAS. 2014, 111, 16160–16165.
【4】 張紹峰等. 植物非編碼RNA調(diào)控春化作用的表觀遺傳. 遺傳. 2012, 34(7): 829-834.

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