RNA的熒光原位雜交（FISH）長期以來一直是用于檢測和定位RNA的不可或缺的工具，是其他基因表達分析方法重要的補充。覺得很復(fù)雜？只需不到一天就可以完成！

Biosearch提供了一種簡潔的RNA FISH方案，可用于在固定哺乳動物細(xì)胞中同時成像多種原始和成熟mRNA、lncRNA、和RNA變體。該技術(shù)利用熒光預(yù)標(biāo)記的短DNA寡核苷酸（長度約20個核苷酸），合并組成探針組（一組可多達48個獨立探針）。多個寡核苷酸與相同一RNA靶標(biāo)的整體結(jié)合，不需要酶反應(yīng)的信號擴增，即可產(chǎn)生強熒光信號，顯示RNA或單RNA分子簇為點狀斑點。陽性信號是由多個探針的組合定位熒光來確定的。單個探針的脫靶結(jié)合僅產(chǎn)生弱的和擴散的熒光，遠低于用于檢測特異性靶向的閾值；集體脫靶可能性很小，這使得假陽性和假陰性的可能性都降至最低。這種設(shè)計使得Stellaris RNA FISH探針可以結(jié)合到部分降解的靶mRNA，使得它們非常適合福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣品。通過使用寬場熒光顯微術(shù)，這些點狀信號的可視化使得能夠?qū)�單個轉(zhuǎn)錄物的計數(shù)靈敏度精確至每個細(xì)胞一個拷貝。此外，通過使用具有不同光譜熒光基團的探針組，可以實現(xiàn)對基因特異性RNA或RNA變體的多重分析。

RNA FISH對于長非編碼RNA（lncRNA）尤其重要。lncRNA由于缺乏蛋白質(zhì)產(chǎn)物和通常存在多個剪接變體，作用機制不明確，對其研究頗具挑戰(zhàn)性。RNA FISH不單可以定位lncRNA，還增加了區(qū)分原始和成熟lncRNA轉(zhuǎn)錄物的能力，并由此得以將作用位點與合成位點分開，可在轉(zhuǎn)錄事件和成熟lncRNA的位置和耐久性之間添加時間空間信息，是lncRNA分析的有用工具。

Biosearch用于檢測選定lncRNA靶標(biāo)的探針組，包含MALAT1，NEAT1 5'區(qū)段，NEAT1中間區(qū)段和XIST。以這些探針組定位的lncRNA能夠清楚的區(qū)分對位核斑體（paraspeckles）中的NEAT1，核斑體（speckles）與MALAT1。

Stellaris RNA FISH（熒光原位雜交）是一種RNA可視化方法，可使用寬視場或共聚焦熒光顯微鏡同時檢測，在亞細(xì)胞水平上對固定樣品中的單個RNA分子進行定位和定量。一組Stellaris RNA FISH探針包含具有熒光標(biāo)記的多個不同序列的寡核苷酸，可沿相同靶標(biāo)共同結(jié)合到目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上，產(chǎn)生點樣熒光信號。

Stellaris RNA FISH技術(shù)遵循一個簡單的方案，無需使用外來試劑，價格經(jīng)濟，和平臺無關(guān)。當(dāng)天即可提供結(jié)果，樣品類型和應(yīng)用類型都可以多種多樣。 Stellaris RNA FISH探針甚至可以用幾種不同的染料標(biāo)記，以實現(xiàn)不同RNA靶標(biāo)的同時多重檢測。綜上，科學(xué)家可以以此追蹤基因表達的隨機性質(zhì)，不用分離純化和擴增，通過直接檢測來觀察RNA。

靈敏度和特異性

Stellaris RNA FISH分析中的大多數(shù)探針確保兼具高靈敏度和高特異性。這種直接檢測方法的固有冗余度能保證假陰性和假陽性信號的可能性最小化。陽性信號是由多個探針的組合定位熒光來確定的。單個探針的脫靶結(jié)合僅產(chǎn)生弱的和擴散的熒光，遠低于用于檢測特異性靶向的mRNA的閾值。更重要的是，Stellaris RNA FISH探針可以結(jié)合部分降解的靶mRNA，使得它們非常適合福爾馬林固定，石蠟包埋（FFPE）組織樣品。

多重靶標(biāo)
Stellaris RNA FISH探針有多種熒光基團可供選擇，包括Biosearch Technologies的CALFluor和Quasar染料，可用于多重靶標(biāo)測定。多重測定中的染料選擇在很大程度上由研究者可用的濾光片確定。可以設(shè)計包括DAPI核染+三種光譜重疊最少的熒光報告基團標(biāo)記的Stellaris RNA FISH探針組。

多重測定可用于鑒定多個基因之間的表達水平的相關(guān)性，同時運行一個已知表達目標(biāo)的對照探針組。Biosearch提供了適用于人類細(xì)胞作陽性對照的目錄探針集。這些基礎(chǔ)基因探針集用Quasar 570染料標(biāo)記。

Stellaris RNA FISH還可以與現(xiàn)有技術(shù)如qPCR，DNA FISH，IHC（免疫組織化學(xué)）和western印跡結(jié)合以提供補充信息。

Stellaris RNA FISH方法 由四個步驟組成，不需要特殊的試劑，整個過程可以在不到一天內(nèi)完成。

步驟1：準(zhǔn)備樣品
樣品在＃1蓋玻片上生長或粘附或切片，并用70％乙醇透化。在不同樣品類型的樣品制備會有輕微變化。都不需要蛋白酶。

步驟2：雜交探針
對于大多數(shù)樣品，雜交可以在通常的實驗室培養(yǎng)箱中在+ 37℃下在4小時內(nèi)完成。

步驟3：洗滌樣品
雜交后，洗滌緩沖液短暫孵育以除去過量的探針。此步驟的總時間為1 - 1.5小時。

步驟4：樣本成像
樣品可以使用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡成像。建議使用寬場熒光顯微鏡。共焦顯微鏡也可以使用Stellaris RNA FISH探針。

lncRNA研究案例：

來自麻省理工學(xué)院Tyler Jacks實驗室的Dimitrova等人在Molecular Cell發(fā)表的一篇論文，使用Stellaris RNA FISH技術(shù)回答了關(guān)于“促細(xì)胞凋亡的lncRNA（lncRNA-p21）是否可以通過順式或反式作用機制調(diào)節(jié)來附近基因”的問題。lncRNA-p21和p21的表達是響應(yīng)p53信號通路的活化刺激。這一通路涉及到腫瘤的抑制、并且是響應(yīng)DNA損傷和細(xì)胞應(yīng)激引起的，一直是一個重要的研究領(lǐng)域。

研究人員想要研究lncRNA-p21作用于影響p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的機制。長片段非編碼RNA能順式調(diào)節(jié)位于其轉(zhuǎn)錄位點附近的基因的表達，有時其作用范圍會擴展更遠一些——作用于同一染色體上更遠距離的基因。相比之下，反式作用的lncRNA作用于獨立位點，抑制或激活基因表達。

作者使用Stellaris RNA FISH進行定位研究，并得出結(jié)論：lncRNA-p21以順式作用調(diào)節(jié)p21表達。首先，作者用TAMRA標(biāo)記的Stellaris RNA FISH探針顯示證明了lncRNA-p21定位于細(xì)胞核。然后，在缺乏lncRNA-p21的細(xì)胞中進行陰性對照實驗，其中超過90％的lncRNA-p21 -/- 細(xì)胞不含有l(wèi)ncRNA-p21熒光星狀RNA FISH信號。

接下來，作者通過針對lncRNA-p21內(nèi)含子、標(biāo)記有Quasar 670染料的Stellaris FISH探針，進行單基因iceFISH（TM）分析，以鑒定其表達位置的基因組位點。iceFISH使用Stellaris探針靶向RNA內(nèi)含子。由于內(nèi)含子在剪接后迅速降解，因此可以測量積極轉(zhuǎn)錄的基因。由于內(nèi)含子探針標(biāo)記采用不同于外顯子探針組的熒光團，因此作者能夠觀察到外顯子和內(nèi)含子lncRNA-p21信號之間的緊密共定位（參見下圖，這是如何工作的示例圖）。結(jié)果表明，這種特異的lncRNA可以通過順式機制作用于p21基因。利用Stellaris RNA FISH還另外收集了順式作用機制的進一步證據(jù)：在lncrRNA-p21 -/- MEFs中，lncRNA-21的過表達不能挽回p21水平，并導(dǎo)致過表達的RNA在細(xì)胞質(zhì)的不當(dāng)定位和輸出。

iceFISH：使用Stellaris探針靶向RNA內(nèi)含子。因為內(nèi)含子在剪接后快速降解，這就使得測量活躍轉(zhuǎn)錄的基因成為可能。