RNA分子在細胞里的定位很可能與其功能有聯系。要研究其功能您當然得搞清楚目標在哪里分布。Stellaris®的RNA熒光原位雜交是一個RNA可視化方法，在熒光顯微鏡下、在亞細胞水​​平上對固定樣品中的特定RNA分子進行檢測，定位，和定量。一組Stellaris RNA FISH探針包含有多個不同序列的熒光標記寡核苷酸，能共同沿著目標序列結合在同一檢測目標上并產生點狀熒光信號。

聰明設計

用反義RNA長探針雖然專一性高，但是長片段標記的不均勻和長片段可以結合多個分子，使得結果的信號很不均勻且不容易定量比較，后來采用標記的合成寡核苷酸探針進行RNA FISH，則短探針存在特異性低，每個探針信號非常低的問題。

Stellaris RNA FISH探針組的特點是對同一目標使用多個不同序列的探針來確保高靈敏度和特異性。陽性信號來自結合在同一目標上多個局部探針的組合熒光。例如，每個RNA分子設計30-48個獨立的單基團標記的探針，這相當于在一個目標分子上安插了這么多熒光標記，使得信號明顯增強。單個探針的脫靶結合僅產生弱的和擴散的熒光，遠低于檢測特異性目標RNA的閾值。這種設計使得它可以結合部分降解的靶RNA——只要沒完全降解，殘留的序列依然有部分探針可以識別結合并向您打小報告，無所遁形——所以這種方法非常適合福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）組織樣品。

Stellaris RNA FISH技術遵循一個簡單的方案，不需使用外來試劑，便宜（嗯，相對的），和平臺無關；可提供當天的結果，很多樣品類型和應用適用。 Stellaris RNA FISH探針甚至可以用幾種不同的染料標記，以實現不同RNA靶標的同時多重檢測。借助這種方法，您可以無需分離，純化和擴增，通過直接檢測來可視化RNA，從而追蹤“飄忽難確定的”RNA分子或者基因表達。

步驟簡單

Stellaris RNA FISH方法相對簡單，由四個步驟組成，如下圖所示。不需要特殊試劑，整個過程可以在不到一天內完成。

步驟1：準備樣品：樣品在＃1蓋玻片上生長或粘附或切片，并用70％乙醇透化。不同生物體和樣品類型之間的樣品制備方案也許會有輕微變化。不需要蛋白酶。

步驟2：雜交探針：對于大多數樣品，雜交可以在常規實驗室培養箱中+ 37℃下在4小時內完成。

步驟3：洗滌樣品：雜交后，用洗滌緩沖液短暫孵育來除去過量的探針。此步驟的總時間為1 - 1.5小時。

步驟4：樣本成像：可以使用標準熒光顯微鏡成像。建議使用寬場熒光顯微鏡，雖然共聚焦顯微鏡也可以使用Stellaris RNA FISH探針。

Stellaris RNA FISH探針提供多種熒光標記，包括Biosearch Technologies的CALFluor®和Quasar®染料，均可用于多重檢測。多重檢測中的熒光標記的選擇在很大程度上取決于您可用的濾光片。可以設計包括DAPI核染色和三種具有最小的光譜重疊熒光標記的Stellaris RNA FISH探針組的檢測。

多重檢測可用于鑒定多個RNA分子之間的表達水平的相關性，例如用已知表達的對照探針組與目標同時檢測。廠家提供適合用作陽性對照的人類細胞庫存探針組，這些基礎的探針集一般用Quasar 570染料標記。Quasar®染料可作為Cy™染料的直接替代品，它們具有相同的發色團結構和光譜性質，連接試劑不同，表現相同。 Quasar 570代替Cy3，Quasar 670代替Cy5，Quasar 705代替Cy5.5染料。 Quasar染料可作以亞酰胺（amidite）形式在寡核苷酸合成期間摻入，因此不需要在合成寡核苷酸后進行標記（偶聯熒光基團）。Quasar稍微更疏水，可溶于DNA合成試劑。

在lncRNA研究中的應用

長的非編碼RNA（lncRNA）靶由于缺乏蛋白質產物和通常存在多個剪接變體，其研究頗具挑戰性。RNA FISH技術能實現對lncRNA的定位，定量和檢測，對于長非編碼RNA（lncRNA）非常重要。Biosearch的研究人員給出了一種簡化的RNA FISH方案，可以在固定哺乳動物細胞中同時成像多種原始和成熟mRNA和lncRNA基因產物和RNA變體，使得RNA FISH技術增加了區分初級和成熟lncRNA轉錄物的能力，并因此可將lncRNA的作用位點與合成位點區分。

該方法利用熒光預標記的短DNA寡核苷酸（長度約20個核苷酸），合并成多達48個單獨探針的組。多個寡核苷酸與相同RNA靶標的整體結合，共同產生的點狀斑點熒光信號可顯示RNA或單RNA分子的簇，而不需要酶信號擴增。通過使用寬視場熒光顯微術，這些點狀信號的可視化使單個轉錄物的計數靈敏度提高到每個細胞一個拷貝。另外，通過使用不同光譜熒光基團的探針組，可以實現基因特異性RNA或RNA變體的多重分析。這種方法能夠在轉錄事件和成熟lncRNA的位置和耐久性之間添加時間空間信息。通過圖像的后處理和點計數，可證明這種方法用于統計分析每個細胞的RNA分子的能力。該信息可用于確定總體基因表達水平和細胞與細胞基因表達變異。詳情請聯系基因有限公司

其他

Stellaris RNA FISH還可以與現有技術例如qPCR，DNA FISH，IHC（免疫組織化學）和western印跡結合以提供補充信息。

Biosearch作為寡核苷酸合成大廠，有豐富的Shipready即用型探針可供選擇，如果還找不到合適的，恭喜您目標獨到領先不隨大流之余，還告訴您Biosearch的人性化服務可以專門為您感興趣的RNA序列設計一套匹配的寡核苷酸探針，回避可能有疑義的會產生背景的保守區同源區等等等等，為您合成這些探針組，并用您選擇的熒光基團標記。怎么樣，約不約？