之前，外泌體（exosome）及其他細胞外囊泡（EV）一直是不起眼的灰姑娘，而最近診斷和治療潛力的發現，仿佛給這些小囊泡穿上了水晶鞋，使其一晃變成光彩奪目的公主。

眾所周知，細胞不斷向細胞外空間分泌大量的小囊泡。這些小囊泡的直徑大多為50-200 nm，脂雙層結構，介導了細胞間的運輸。至于運輸了什么，人們沒有太在意，大抵是一些不重要的蛋白吧。直到最近，人們才發現他們錯了。exosome及其他細胞外囊泡正起著不可缺少的細胞通訊作用。

小囊泡，大潛力

在腫瘤發展過程中，exosome介導了關鍵的步驟，如刺激血管生成，削弱免疫反應，甚至參與了轉移前微環境的形成。在正常的生理和妊娠過程中，exosome也起了重要作用，如胎盤exosome幫助形成對母親免疫系統的免疫抑制屏障。總之，在正常和病理的條件下，細胞都釋放小囊泡，以各種方式影響其他細胞。

這些囊泡中的核酸成分，尤其是RNA，引起了人們的極大興趣。相對于血液中那些“無瓦遮頭”的RNA，囊泡為RNA創造了一個天然的穩定環境，保護它們免受RNase的降解。通過RNA-Seq、雜交芯片及其他方法的分析，人們發現囊泡中存在過去未知的各種轉錄本，包括miRNA和其他種類的小分子非編碼RNA，以及mRNA、tRNA、lncRNA和rRNA。

因此，exosome及其他細胞外囊泡有望作為生物標志物，在癌癥及其他疾病的診斷中發揮一定的作用。囊泡的脂雙層結構使得新鮮和長期保存的樣本皆可用于RNA分析，甚至一些冷凍達十二年之久的樣本也能產生高質量的RNA。當然，我們首先得分離出這些小囊泡。

超速離心是分離小囊泡的常用方法，產量高，質量也OK，不過首先你得有一臺超速離心機。而且，整個過程耗時耗力，還需要精心優化操作。目前沒有標準化的操作可循，實驗室使用不同的前處理以及不同的超速離心操作。這就使得各個實驗室之間的結果幾乎沒辦法比較。后來，人們又開發出多種替代方法，如抗體捕獲、聚合物沉淀等，有一定的作用，但也存在一些缺點。

為此，Exosome Diagnostics公司開發出一種基于離心柱的簡便方法來分離EV，并提取出其中的RNA。上個月，研究人員在《PLoS ONE》上介紹了這種新方法。與超速離心相比，這種方法能分離出高純度的RNA，并且對囊泡RNA有著高的特異性。離心柱能夠容納4 mL樣本，實現了血清和血漿中低豐度轉錄本的檢測。目前，基于此技術的商業化產品 – exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit – 已由QIAGEN推出。文章以此為例進行了詳細介紹。

離心柱，更方便

這種方法使用了膜親和結合步驟來分離exosome及其他EV。它無法通過大小或細胞來源對EV進行區分，也不依賴于是否存在微粒表位。它運用了囊泡的通用生化特性來提取樣本中的所有細胞外囊泡。因此，在開始提取前需要對樣品進行離心或過濾操作，以便完全去除細胞、細胞碎片、凋亡小體等組分。

整個實驗流程，從血清/血漿樣本到RNA產物，只需1小時。實驗包括兩步：純化exosome和分離RNA。在exosome純化步驟，預過濾的血漿與結合緩沖液（XBP）混合后，加至exoEasy親和性膜離心柱上，讓囊泡與膜結合。離心之后，使用洗滌緩沖液（XWP）洗滌結合在膜上的囊泡，之后利用QIAzol裂解。在RNA分離步驟，QIAzol洗脫液中加入氯仿，回收水相，將其與乙醇混合。總RNA結合到離心柱上，洗滌三次后洗脫。

研究人員發現，與超速離心法相比，新的方法不僅速度更快，而且產物純度更高。掃描電鏡顯示，雖然這兩種純化技術都能夠純化預期大小（50-200 nm）的完整的囊泡，但超速離心的產物還含有很多不符合預期、更小或其他形狀的細胞結構（圖1）。

 
圖1：分離后囊泡的掃描電鏡分析。左：超速離心法；右：exoEasy的洗脫物（圖片來自PLoS ONE）

既然exosome及其他細胞囊泡有望用于生物標志物的發現和診斷的開發，那么RNA制備的質量和重復性可是相當重要的。為此，研究人員也使用Bioanalyzer對這兩種方法分離的囊泡RNA大小進行分析。他們對血漿進行預過濾（0.8 µm），去除較大的微粒，之后通過目前常用的超速離心法，或exoRNeasy方法分離囊泡。分析表明，兩種方法純化所得的RNA在大小和產量上相似。

 
圖2：癌癥患者血漿的總RNA大小分布圖。（圖片來自PLoS ONE）

至于離心柱分離了哪些種類的RNA，研究人員也進行了深究。他們使用最小的起始樣品量0.2 mL，利用RT-qPCR對exoRNeasy純化的RNA產物和exoEasy分離柱的流出液進行分析。結果顯示，exoRNeasy的產物包括血漿中所有mRNA，以及特定的miRNA，如let-7a和miR-142-3p（圖3）。同時，一些無細胞的循環miRNA和與Ago2蛋白結合的miRNA則保留在流出液中。

 
圖3：血漿中mRNA和miRNA的回收。（圖片來自PLoS ONE）

這種離心柱的方法不僅簡便，也能夠擴展。當樣本體積有限，或感興趣的轉錄本以高拷貝數存在時，你可以使用200 μL或更少的體積；而對于稀有轉錄本的檢測，或下游分析是芯片或測序時，你也可以使用4 mL或更多的體積。你看，就是這么任性。

研究人員認為，這種基于離心柱的新方法與現有的產品和操作相比，展現出相當或更好的RNA產量和純度，同時可適應大范圍的樣品量，實現低豐度轉錄本的檢測。它特異性分離EV中包含的RNA，而排除蛋白相關的循環RNA，帶來了一個方便快捷的流程，適合常規使用。

囊泡，快到碗里來

也許，你更感興趣的是囊泡本身，而不是其中的RNA。那么，你可以試試QIAGEN新的exoEasy Maxi Kit。它可從血漿、血清及細胞培養上清中純化exosome及其他EV。

exoEasy Maxi Kit的原理同上，使用離心柱及專門的緩沖液來從預過濾的生物液體中純化exosome；可處理高達4 mL的血漿或血清。對于細胞培養上清，經實驗驗證可從高達32 mL的樣品中成功提取exosome。不過，上清中的囊泡濃度依賴于細胞類型及培養條件；因此QIAGEN建議上清體積不要超過16 mL。更高的樣品體積可能導致囊泡的回收率降低。

整個流程僅僅需要25分鐘。將預先過濾過的血漿、血清或細胞培養上清與Buffer XBP進行混合并結合在exoEasy膜親和離心柱上。對結合的exosome使用Buffer XWP進行清洗，隨后使用Buffer XE（主要含無機鹽的緩沖液）進行洗脫，即可用于物理或生化分析。不過，對于生物檢測等特定應用，可能需要進行額外的濃縮或緩沖液置換。此步驟可通過孔徑尺寸為100 kDa或更小的超濾方法來實現。

提取獲得的囊泡具有完整的功能，可用于多種下游應用。比如通過納米顆粒追蹤分析（NTA）或可調電阻脈沖感應（TRPS）對其物理性質進行分析，或者利用電子顯微鏡分析。當然，你也可以提取出其中的DNA、RNA、蛋白或脂類，開展進一步的分析。

現在，你是不是對exosome分析如釋重負了呢。沒有超速離心機，只有普通離心機，我們一樣能獲得高純度的exosome。

目前，QIAGEN提供了四種exsome研究相關試劑盒。 exoRNeasy Maxi kit用于exosome分離；其他三種純化囊泡RNA的試劑盒，Maxi最多可處理4 mL的血清/血漿；Midi的處理量不大于1 mL。如果你需要處理不同起始量的樣品，Starter Kit則最合適。

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（生物通 余亮）

參考文獻：

Enderle D, Spiel A, Coticchia CM, Berghoff E, Mueller R, Schlumpberger M, et al. (2015)
Characterization of RNA from Exosomes and Other Extracellular Vesicles Isolated by a Novel Spin Column-Based Method. PLoS ONE 10(8): e0136133. doi:10.1371/journal.pone.0136133