生物通報(bào)道  來(lái)自哈佛大學(xué)、麻省總醫(yī)院的研究人員報(bào)告稱(chēng)，他們通過(guò)采用小分子激活條件性Cas9蛋白的新策略，將基因組編輯的特異性提高了25倍。

論文的通訊作者是哈佛大學(xué)化學(xué)及化學(xué)生物學(xué)教授，霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員David R. Liu。據(jù)稱(chēng)這位教授是一位從來(lái)沒(méi)有做過(guò)博士后的年輕教授，他早年畢業(yè)于哈佛大學(xué)，1999年在加州大學(xué)伯克利校區(qū)攻讀博士學(xué)位，在Peter Schultz教授指導(dǎo)下從事核糖核酸研究，并自主首次開(kāi)始活細(xì)胞遺傳密碼的研究。之后就被哈佛大學(xué)任命為助教授，2004年晉升為教授。Liu教授曾被麻省理工學(xué)院技術(shù)評(píng)論列入全球Top 100 青年發(fā)明家（35歲以下），“大眾科學(xué)”亦將其列入全美Top10最具才氣的青年科學(xué)家（延伸閱讀：哈佛華裔牛人Nature子刊發(fā)布基因組編輯新技術(shù) ）。

作為一種對(duì)抗入侵病毒和質(zhì)粒的防御系統(tǒng)，CRISPR-Cas系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中。來(lái)自化膿鏈球菌的II型CRISPR-Cas系統(tǒng)依賴(lài)于一種蛋白核酸酶Cas9和兩個(gè)非編碼RNA: crRNA和tracrRNA來(lái)靶向DNA。這兩個(gè)非編碼RNAs可進(jìn)一步融合成一種單導(dǎo)向RNA (single-guide RNA,sgRNA)。Cas9/sgRNA復(fù)合物結(jié)合到與sgRNA的前17-20個(gè)核苷酸相匹配的雙鏈DNA序列上，以NGG序列形式存在的的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif, PAM）緊隨在這一靶序列之后。

一旦結(jié)合，Cas9中兩個(gè)獨(dú)立的核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)��?huì)在PAM區(qū)上游對(duì)基因組DNA進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂(DSB)。DSBs可通過(guò)非同源末端連接(nonhomologous end-joining,NHEJ)信號(hào)通路或是同源介導(dǎo)的修復(fù)(Homology-directed repair, HDR)來(lái)獲得修復(fù)。NHEJ通常會(huì)在切割位點(diǎn)附近造成短插入/刪除(indels)，而在提供外源模板DNA的情況下可以利用HDR將特異序列導(dǎo)入到切割位點(diǎn)。這一研究發(fā)現(xiàn)為Cas9作為一種基因工程工具應(yīng)用于各種物種中鋪平了道路。

近年來(lái)，多個(gè)研究小組利用錯(cuò)配gRNA文庫(kù)、體外篩選和報(bào)告基因檢測(cè)廣泛地鑒別了化膿鏈球菌Cas9的特異性，證實(shí)Cas9以一種對(duì)錯(cuò)配數(shù)量、位置和分布敏感的方式可以容忍導(dǎo)向序列中的一些錯(cuò)配。由于基因組編輯是造成基因組永久的改變，Cas9的靶向特異性成為了其是否適用于臨床應(yīng)用及基因治療的一個(gè)尤為關(guān)切的問(wèn)題。提高特異性也是當(dāng)前Cas9系統(tǒng)應(yīng)用研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。

在這篇新文章中作者們提出，在靶向位點(diǎn)修飾后直接調(diào)控及降低基因組編輯蛋白的活性，有可能是提高它們特異性的一種潛在方法。他們通過(guò)將4-羥基他莫昔芬（hydroxytamoxifen）反應(yīng)性的內(nèi)含肽(Intein)插入到Cas9的特異位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出了可被一種細(xì)胞滲透性小分子激活的Cas9核酸酶。他們證實(shí)在人類(lèi)細(xì)胞中，相比于野生型Cas9，這些條件性激活的Cas9s將改造靶基因組位點(diǎn)的特異性提高了25倍。

這一重要的研究成果發(fā)表在4月6日的《自然化學(xué)生物學(xué)》（Nature Chemical Biology）雜志上。

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

Small molecule–triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity

Directly modulating the activity of genome-editing proteins has the potential to increase their specificity by reducing activity following target locus modification. We developed Cas9 nucleases that are activated by the presence of a cell-permeable small molecule by inserting an evolved 4-hydroxytamoxifen–responsive intein at specific positions in Cas9. In human cells, conditionally active Cas9s modify target genomic sites with up to 25-fold higher specificity than wild-type Cas9.