在細(xì)胞中，蛋白質(zhì)并不是孤單的個體。大多數(shù)蛋白通過與分子伴侶或其他蛋白形成復(fù)合物而發(fā)揮其功能。因此，在了解細(xì)胞的生物學(xué)特性時，蛋白質(zhì)相互作用（PPI）研究就成了重要一環(huán)。在藥物開發(fā)的過程中，這一信息也至關(guān)重要，有助于確認(rèn)藥物靶點(diǎn)。

一提起蛋白質(zhì)相互作用研究，你的腦海中可能馬上浮現(xiàn)出：酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)。的確，這些都是經(jīng)典方法，可有效檢測體內(nèi)體外蛋白質(zhì)相互作用。然而，它們不能提供動態(tài)的蛋白相互作用信息，似乎還缺乏一些說服力�；�于此，共振能量轉(zhuǎn)移這種方法受到人們的青睞。這種能量轉(zhuǎn)移有著嚴(yán)格的距離限制（< 10 nm），特別適合評估蛋白質(zhì)的相互作用。

它的原理并不復(fù)雜，就是兩個蛋白分子靠近時，激發(fā)態(tài)能量從一個熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一個。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）都屬于這種方法。它們的主要區(qū)別在于，F(xiàn)RET涉及到兩個熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移，其中一個需要適當(dāng)光源的外部激發(fā)，而BRET在底物被氧化之后發(fā)生，因此不需要外部激發(fā)。如此看來，BRET相對FRET有不少優(yōu)點(diǎn)，比如無需激發(fā)光，背景更低，也避免了光漂白和自發(fā)熒光等問題。

BRET最初是在海洋生物中觀察到的，如水母和海腎。之后，人們將其用于動物和植物研究。在BRET技術(shù)中，蛋白A融合螢光素酶（通常是海腎螢光素酶），作為能量供體，蛋白B則融合帶有熒光基團(tuán)的標(biāo)簽蛋白，作為能量受體。如果蛋白A和B存在相互作用，加入螢光素酶底物后，螢光素酶發(fā)光可以激發(fā)鄰近的蛋白B的熒光基團(tuán)發(fā)光。如果沒有相互作用，那就沒有熒光咯。

大幅改良的BRET平臺

目前，人們大多使用海腎螢光素酶（Rluc）作為能量供體，黃色熒光蛋白（YFP）作為能量受體，在這之間實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移。然而，Rluc和YFP的光譜接近，產(chǎn)生了明顯的背景。這種高背景增加了檢測噪音，也降低了靈敏度和動態(tài)范圍。

于是，Promega對BRET方法進(jìn)行大幅改良。它使用NanoLuc® 螢光素酶作為能量供體，而HaloTag® 蛋白標(biāo)記的NanoBRET™ 618熒光基團(tuán)作為能量受體，帶來了最新的NanoBRET™ 技術(shù)。

集兩大專利于一身的NanoBRET™，可不是鬧著玩的。NanoLuc® 螢光素酶的分子量僅為19 kDa（171個氨基酸），更適合于構(gòu)建融合蛋白。別看它小，它的光信號比海腎螢光素酶高兩個數(shù)量級，因此極少量也能準(zhǔn)確定量，特別適合細(xì)胞水平蛋白相互作用的研究。

至于能量受體，Promega利用HaloTag® 蛋白標(biāo)簽技術(shù)來構(gòu)建。在評估了一系列熒光基團(tuán)之后，他們選擇了NanoBRET™ 618配基。它與NanoLuc® 的波長配對更加，使得檢測數(shù)據(jù)更加出眾。于是，來自NanoLuc® 供體的明亮的藍(lán)移發(fā)光信號耦合到遠(yuǎn)紅移的HaloTag® 受體上后，光譜疊加更佳、信號更強(qiáng)、且與傳統(tǒng)的BRET分析相比背景更低。

如何構(gòu)建載體？

也許你接著要問，NanoBRET™ 性能不錯，但操作起來會不會很麻煩。如果你想省時省力，可以選擇預(yù)構(gòu)建載體。NanoBRET™ 預(yù)構(gòu)建載體融合了已知相互作用的蛋白的基因，無需你再自行構(gòu)建載體，可直接用于轉(zhuǎn)染，進(jìn)行藥物作用機(jī)理及其他相關(guān)的機(jī)制研究。

Promega目前提供了許多經(jīng)過優(yōu)化的NanoBRET™ 檢測，包括表觀遺傳學(xué)檢測，可研究溴結(jié)構(gòu)域（bromodomain）與組蛋白的相互作用。此外，轉(zhuǎn)錄蛋白、信號蛋白和膜蛋白等方面也有不少產(chǎn)品，具體可登陸Promega的網(wǎng)站查詢（www.promega.com）。

如果這其中沒有你的研究目標(biāo)，也不必遺憾，自行構(gòu)建就是了。相信對大家來說，這種克隆是so easy，況且Promega也提供了方便的Flexi 載體克隆系統(tǒng)。這是一種定向克隆技術(shù)，基于兩個稀有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，SgfI和PmeI。它能夠快速、高效、高保真性地在不同 Flexi 載體間轉(zhuǎn)移蛋白編碼區(qū)，而無需重新測序。

NanoBRET™ PPI Flexi Starter System 就以Flexi 載體為基礎(chǔ)，提供了蛋白相互作用檢測的解決方案，包括載體，檢測試劑及陽性對照。這個過程很簡單，就是經(jīng)典的酶切連接過程，也不需要構(gòu)建入門載體。由于載體本身在SgfI和PmeI酶切位點(diǎn)之間是一個致死基因，這使得陽性克隆的幾率大大增加，但也帶來載體保存的問題。我們無法復(fù)制，只能每次向廠家購買。

當(dāng)然，你也可以選擇另一個常規(guī)方案，利用多克隆位點(diǎn)（MCS）來克隆。Promega的NanoBRET™ PPI MCS Starter System提供帶有多克隆位點(diǎn)的NanoLuc® 融合蛋白克隆載體和HaloTag® 融合蛋白載體，以及檢測試劑和陽性對照。這些組分也可以單獨(dú)購買。

別人怎么用？

研究人員已經(jīng)利用NanoBRET™ 技術(shù)發(fā)表了不少文章。今年1月，清華大學(xué)和賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員在研究Rabin8的蛋白構(gòu)象是否起著自抑制作用時，就使用了NanoBRET™ 技術(shù)1。

Rab蛋白是Ras超家族中的一類，也是一類低分子量的GTP結(jié)合蛋白（大約20-29 kDa），它們負(fù)責(zé)調(diào)控真核細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸?shù)冗^程。其中，Rab8是胞吐作用的一個關(guān)鍵調(diào)控因子。Rabin8是一種鳥苷酸交換因子（GEF），也是Rab8的主要激活因子。

在這項(xiàng)研究中，研究人員構(gòu)建了Rabin8重組體，在N端融合NanoLuc® 螢光素酶，C端融合HaloTag® 蛋白，這樣他們就能利用BRET作為蛋白構(gòu)象的指示劑。同時，他們采用突觸融合蛋白-4（syntaxin-4）重組體作為陽性對照。之后在大腸桿菌中表達(dá)兩個重組體，并加入NanoBRET™ Nano-Glo® 底物，測定熒光。

通過比較Rabin8和Rabin8突變體的信號，研究人員確定磷酸化作用是Rabin8激活的一個重要機(jī)制。他們證實(shí)了Rabin8是ERK1/2響應(yīng)EGF信號的一個直接磷酸化作用底物。在分子水平上，ERK1/2磷酸化Rabin8減輕了它的自抑制，由此促進(jìn)了Rabin8的GEF活性。這項(xiàng)研究確定了Rabin8激活的一種分子機(jī)制。

關(guān)于NanoBRET™ 技術(shù)的更多文獻(xiàn)，以及詳細(xì)資料和報價，請點(diǎn)擊此處向Promega索取。（生物通 余亮）

參考文獻(xiàn)：

1. Juanfei Wang, Jinqi Ren, Bin Wu, et al., Activation of Rab8 guanine nucleotide exchange factor Rabin8 by ERK1/2 in response to EGF signaling, PNAS, 2015 112(1):148-53.