Western blot實驗的失敗，那都是家常便飯。據Bio-Rad統計，大約一半的研究人員表示，他們Western blot的失敗率至少在25%。如此高的失敗率，難怪會讓人心慌慌。況且整個實驗流程那么長，辛苦一整天，得到一張“白板”，還真是有點不甘心。

其實，我們會如此焦慮，是因為實驗過程中幾乎沒什么機會來檢查結果是否和預期的一致。我們只能通過預染marker來了解大致情況。如果在Western blot流程中加入檢查點，確保每一步都獲得可靠的結果，那勢必能減輕研究人員的焦慮。基于這一考慮，Bio-Rad推出了V3 Western Workflow。

這個V3流程是在傳統的Western流程中引入了創新的免染（Stain-Free）技術。操作過程并沒有什么變化，但能夠大大縮短整個實驗的時間。同時，免染技術讓研究人員能看到凝膠和轉印膜上的蛋白質，而無需染色，也不會影響免疫檢測中的抗體雜交。

V3，這代表什么？據Bio-Rad介紹，V3即V+V+V，但這三個V有著不同的涵義。第一個V代表Visualize。在電泳結束后將凝膠放入Bio-Rad的成像系統中1分鐘激活成像，即可得到一張類似于考馬斯藍染色的圖像，從而判斷分離效果。第二個V是Verify。在轉印結束后，通過成像系統可以看到印跡膜上的蛋白，從而判斷轉印的效率。至于第三個V，就是Validate，利用膜上的總蛋白作為內參來進行定量歸一化。

加州大學戴維斯分校的助理教授Aldrin Gomes認為，這些檢查點的確很有用。“我們能夠對凝膠成像，而無需外部染料，并快速確定凝膠上的樣品是否有問題。在轉印之后，我們同樣對凝膠成像，如果任何一步有問題，我們就停下來。”這個停下來，不僅節約了抗體和時間，也是為了總結經驗教訓后再出發。

V3 Western 流程總共包含五步：

1. 蛋白電泳。利用Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free預制膠或Criterion™ TGX Stain-Free預制膠，以及標準的Tris/甘氨酸緩沖液，快速分離蛋白質。TGX Stain-Free預制膠采用一種獨特的配方，能夠在15分鐘內快速分離蛋白質。

2. 觀察分離。通過免染技術，將凝膠放入ChemiDoc Touch或ChemiDoc™ MP成像系統中激活1分鐘，即可觀察蛋白分離。此技術的原理是將蛋白膠浸泡在三氯乙酸或氯仿中，然后通過紫外光照射。在三氯化合物存在時，紫外光驅使色氨酸發生反應，產物會發出可見區內的光，從而實現蛋白條帶在膠上的定位。這樣無需染色，也能對蛋白分離的情況了如指掌。

3. 蛋白轉印。利用TransBlot Turbo轉印系統和TGX Stain-Free預制膠，最快3分鐘即可完成轉印。TransBlot Turbo，又稱為全能型蛋白轉印系統，一次可轉印4塊mini膠或2塊midi膠。它采用了一種新配方的轉印緩沖液，并使用了一種特殊材質的濾紙。這種組合能夠承受更大電流，使轉印不僅更快，而且更完全。

4. 轉印驗證。同樣，利用ChemiDoc Touch或ChemiDoc MP成像系統，能夠對PVDF或NC膜上的蛋白進行觀察，即時檢查蛋白轉印的效果，而不需要麗春紅染色。如果轉印有問題，那么后續就不需要浪費寶貴的一抗了。

5. Western blot驗證。實驗當然少不了參照。過去的Western blot實驗通常以看家基因作為內參，來確定蛋白質的相對表達量。然而，研究也發現，這些蛋白在病變組織與正常組織間、不同的正常組織間以及同一組織的不同部位都呈現出差異表達。因此，如今人們傾向于選擇總蛋白作為內參。利用ChemiDoc Touch或ChemiDoc™ MP成像系統以及Image Lab軟件，研究人員能夠以總蛋白來進行定量歸一化，從而消除實驗誤差，得到更為可靠的結果。

V3 Western流程中有三款儀器可供選擇，包括ChemiDoc Touch、ChemiDoc MP和Gel Doc EZ系統。其中，ChemiDoc Touch是去年底上市的新產品。它采用創新的鏡頭和光學組件、超高品質CCD，將數字成像系統的靈敏度和圖像質量真正提高到膠片級別，能產生可立即發表的圖像。如何在這三款儀器中做出選擇，請看下表。

以往一整天才能獲得的結果，如今借助這些新穎的技術和儀器，6小時就能完成，而且不是白板哦。老板再也不用擔心我的Western blot了。（生物通 余亮）

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