CRISPR技術為基因組編輯帶來了一種快速簡單的方法，因此備受人們青睞。然而，在具體的實驗過程中，我們也面臨著一些問題。無論是針對目的基因來設計少量sgRNA，還是為覆蓋基因組來設計sgRNA庫，我們都面臨如何選擇的難題。為此，Addgene再次請來了Broad研究院的CRISPR專家John Doench，談談如何優化sgRNA的活性。上一次，Doench介紹了CRISPR實驗中如何設計gRNA。

預測sgRNA的效果

Doench博士最近研究了能增強sgRNA的on-target活性的序列特征。他們發現，一些序列確實比另一些更好，而PAM的變化會導致活性的差異。具體而言，CGGT往往比典型的NGG序列更好。通過研究1841個sgRNA中最有活性的sgRNA，他們得出了評分規則，并建立了一個網站，運用這些規則來設計sgRNA。這個網站的地址是：http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design。

一旦確定了可能最高效的sgRNA，那么下一步需要進行一些過濾，以便進一步篩選。例如，利用目的基因的基本特征來排除一些sgRNA，比如靶定蛋白質C端的那些，因為大部分的蛋白質都已經翻譯，移碼突變不大可能有害。盡管每個蛋白質都不同，但靶位點在前半部分似乎是合理的。不過Doench也提到，對于有些基因，即使有些靶位點非常靠近C端，也能破壞表達。當然，這不能一概而論。

避免脫靶效應

sgRNA的脫靶效應也是一個重要的考慮因素。關于脫靶效應的程度，幾篇論文得出了不同的結論，但至少有一點可以肯定，這些差異的一個原因是Cas9的表達水平和研究中所用的sgRNA。此外，預測基因組中脫靶位點的能力尚處于起步階段。目前還沒有足夠的數據來預測哪些位點可能或不可能表現出明顯的修飾水平。同時，研究也表明，RNA或DNA中的凸起也可能帶來脫靶效應，但現有的算法往往忽略這些位點。

最近一些CRISPR修飾細胞的全基因組測序結果表明了脫靶效應的后果，至少在所使用的實驗條件下，產生了檢測不到的突變。此外，針對同一基因的不同序列表現出高的一致性，表明脫靶效應并沒有壓倒真正的信號。Doench博士再次強調了實驗策略：對于任何感興趣的基因，需要不同序列的多個sgRNA產生相同表型，才能下結論說這個表型是on-target的結果。

怎么會出錯呢？

即使是經過優化的on-target設計，盡力避免off-target效應，顯然并非所有基因在細胞背景中都能輕松靶定。一個主要原因是目的位點的染色質狀態。對于那些受限制染色質中的基因，Cas9顯然不太容易發現它們。在此，單細胞克隆可能是必要的，而RNAi等互補技術也是一個更好的選擇。

總的來說，選擇sgRNA時需要最大限度提高on-target活性，同時降低off-target活性。這聽上去很簡單，但往往也需要艱難的抉擇。例如，到底是選一個活性不太高，但靶定基因組中唯一位點的sgRNA，還是選一個更高效，但靶定兩個位點的sgRNA呢？Doench認為，在創建長期研究所用的穩定細胞模型時，前者可能是更好的選擇。而在利用sgRNA庫進行遺傳篩查時，由后者組成的庫可能更加高效，但在解釋結果時要小心。

Doench認為，這是功能基因組學的最好時代，有越來越多的工具來探索基因功能。然而，再好的工具也不如使用它們的人，CRISPR技術的正確使用取決于精心設計、實施和分析。

如果你還想了解設計sgRNA的更多建議，可以讀一讀John Doench最近發表在《Nature Biotechnology》上的文章，題目為“Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9–mediated gene inactivation”。（生物通 余亮）

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