生物通報道  9月18日，來自中科院遺傳與發育生物學研究所的研究人員在《Nature Protocols》雜志上發表了一篇題為“Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system”的文章，詳細描述了利用CRISPR/Cas系統分步實現水稻和小麥基因組編輯的一種實驗方案。

中科院遺傳與發育生物學研究所的高彩霞（Caixia Gao）研究員是這篇論文的通訊作者。其主要研究領域包括農作物基因組定向編輯技術體系的研究與應用、農作物遺傳轉化技術體系的建立與應用，以及小麥重要功能基因的分子生物學研究。

靶向性基因組編輯技術成為了近年來了解基因功能以及在植物中開發有價值的新性狀的強大工具。鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas系統是構成基因組編輯的三大核心技術。

ZFNs曾被認為是最有潛力的基因改造技術。但鋅指基序（motif）同其靶序列的對應性并不特異，對于每一個特定的靶點，往往需要構建龐大的鋅指表達文庫，通過實驗篩選出高效且特異結合靶序列的鋅指蛋白；而且在基因組上找到合適的ZFN靶點也比較困難。因而這種技術工作量大、花費昂貴且具有毒性。TALEN技術既能夠像ZFN一樣精確地修飾復雜的基因組，又具有比ZFN更容易設計的優點，即具備了ZFNs技術特異結合目標DNA特異性的優點，同時消除了它的一些缺點，比ZFNs更容易設計、特異性更高且毒性更低。

CRISPR／Cas系統廣泛存在于細菌及古生菌中，是機體長期進化形成的RNA指導的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應性免疫系統。針對II型CRISPR／Cas系統進行改造，使其成為了繼ZFNs和TALENs以來的高效定點修飾新技術。相比于ZFNs和TALENs，CRISPR／Cas系統更簡單，并且更容易操作。在這一系統中，只需改變單導向RNA (single-guide RNA,sgRNA)中20個核苷酸（nt）的目標序列就可以靶向不同的基因。簡單的克隆策略和對潛在目標靶點較少的限制使得CRISPR/Cas非常具有吸引力（延伸閱讀：The Scientist:聚焦CRISPR研究先鋒張鋒 ）。

在這篇新文章中，作者們描述了由選擇靶位點，到設計、構建、驗證及利用sgRNAs在水稻和小麥中實現CRISPR/Cas介導序列特異性突變發生及基因打靶的一種分步實驗方案，其中尤為詳細地介紹了sgRNAs和Cas9構建和表達的步驟和時間表。第一階段sgRNAs的構建需用4天時間分11步完成，將靶點特異性的sgRNA寡核苷酸（oligos）克隆到sgRNA支架載體中在原生質體中實現短暫表達。第二階段是進行驗證，大約需要6天時間。第一天，首先分離出原生質體。隨后的兩天，根據第13-25步驟用PEG介導原生質體轉化。再用三天時間，按照第26-29步驟檢測原生質體中的突變。最后一個階段是獲取突變。在隨后的13-17周時間內，按第30-37步利用基因槍實現對水稻的穩定轉化。最后3天，第38-41步則是對轉基因水稻中的插入和缺失（indels）進行檢測和測序。

這篇新文章為我們提供了一種可在1-2周內在原生質體中實現快速基因打靶，并在13-17周內生成突變植物的簡單直接的實驗方案。

（生物通：何嬙）

作者簡介：

高彩霞

女，研究員，博士生導師

1991年獲甘肅農業大學學士。1994年獲甘肅農業大學碩士。1997年獲中國農業大學博士。1997-1998年丹麥DLF-Trifolium公司科研部博士后。1998-2009年丹麥DLF-Trifolium公司科研部Research Scientist，課題組長。2009年9月回國，在遺傳發育所植物細胞與染色體工程國家重點實驗室任研究員，課題組長，2010年入選中國科學院“杰出技術人才”。

主要研究領域：農作物基因組定向編輯技術體系的研究與應用、農作物遺傳轉化技術體系的建立與應用，以及小麥重要功能基因的分子生物學研究。

生物通推薦原文摘要：

Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system

Targeted genome editing nucleases, such as zinc-finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs), are powerful tools for understanding gene function and for developing valuable new traits in plants. The clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)/Cas system has recently emerged as an alternative nuclease-based method for efficient and versatile genome engineering. In this system, only the 20-nt targeting sequence within the single-guide RNA (sgRNA) needs to be changed to target different genes……