標準的免疫檢測是在電轉移后直接在轉印蛋白上開展的。（如果膜在轉移后已干燥，在甲醇中浸泡5分鐘，徹底潤濕印跡，再繼續進行免疫檢測。）濕潤印跡上未被占據的膜結合位點被優化的試劑所封閉（詳見操作1.5 優化封閉試劑，第41頁）。此方法的缺點是需要封閉，且所需的總時間超過4小時。優點是對于新的樣品類型而言，標準的免疫檢測可能需要較少的優化。

提示：Immobilon®-PSQ轉印膜的孔徑（0.2 μm）比Immobilon®-P轉印膜（0.45 μm）更小，且表面積更高。使用Immobilon®-PSQ膜預計會得到更高的背景，封閉和清洗步驟需要相應調整。
提示：封閉液中的磷酸酶可能會使印跡蛋白去磷酸化。
提示：請勿在緩沖液中加入疊氮化鈉，因為它會抑制HRP的活性。
建議 – 在封閉時及之后請勿讓印跡變干。
提示：如果在容器中放入不止一張印跡，緩沖液量不夠將導致印跡粘在一起。
提示：脫脂奶粉不能用于生物素-親和素系統。
提示：顯色檢測的靈敏度至少比化學發光檢測低一個數量級。
提示：高的非特異信號可通過一抗的更高稀釋或降低凝膠上的蛋白上樣量來緩解。
提示：干的或濕的Immobilon®-FL膜均可掃描。
提示：通過酶結合二抗的更高稀釋，可盡量避免高的整體背景。

必需的溶液
• 一抗（目的蛋白特異的）。
• 二抗（一抗特異的），標記堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
• 適合酶的底物。
• 磷酸鹽緩沖液（PBST）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl，最多0.1% 吐溫20去污劑。
• TBST：10 mM Tris、pH 7.4，0.9%（w/v）NaCl，最多0.1% 吐溫20去污劑。
• 封閉液：1%（w/v）BSA（牛血清白蛋白），0.05% 吐溫20。
• Milli-Q® 水。

必需的設備
• 淺托盤，能容納印跡。
• 玻璃板。
• 保鮮膜（如Saran™膜）、冷凍袋或紙片。
• 放射自顯影膠片和暗盒。
• 暗室。
• 放射自顯影膠片沖洗設備。

準備

1. 用封閉液將一抗稀釋到所需的工作濃度。
2. 用封閉液將二抗稀釋到所需的工作濃度。
注意：應準備足夠的溶液，讓每cm2 膜有0.1 mL抗體溶液（一抗和二抗）。

抗體孵育

1. 將印跡放入封閉液中，搖動孵育1小時。
2. 將印跡放入一抗溶液中，搖動孵育1小時。溶液應在膜表面自由移動。
3. 將印跡放入PBS中，清洗10分鐘。用新鮮的緩沖液重復兩次。
4. 將印跡放入二抗溶液中，室溫或37°C搖動孵育1小時。
5. 將印跡放入PBS中，清洗10分鐘。用新鮮的緩沖液重復兩次。
6. 繼續進行顯色、化學發光或熒光檢測。

顯色檢測

1. 根據制造商的說明準備底物。
2. 將印跡放入干凈容器內，加入底物，以完全覆蓋膜表面。輕柔搖動孵育10分鐘，或直至信號達到所需的對比度。
3. 用Milli-Q® 水沖洗印跡，終止反應。
4. 不要將印跡保存在直射光下，以避免退色。印跡可干燥保存。

化學發光檢測

根據制造商的說明操作。
1. 根據制造商的說明準備底物。
2. 將印跡放入容器內，加入底物，以完全覆蓋膜。孵育1分鐘。
3. 吸走多余的底物。
4. 將印跡放在一片干凈的玻璃上，包在保鮮膜中。
注意：切成一定尺寸的紙片或冷凍袋也可使用。
5. 輕輕去除所有氣泡。
6. 在暗室中，將包好的膜放在膠片暗盒中。
7. 將一張放射自顯影膠片放在上面，蓋上暗盒。
8. 曝光膠片。應采用多次曝光，從15秒到30分鐘，以確定最佳的曝光時間；通常是1-5分鐘。

熒光檢測

必需的設備
• 蛋白轉印到Immobilon®-FL轉印膜上，并與抗體雜交。
• Mylar® 薄膜
• 熒光成像設備。

以下是熒光免疫檢測的常規操作。為獲得最佳結果，請參考隨試劑提供的制造商操作指南。注意：如果使用化學熒光試劑，請按照試劑制造商的指南。

1. 將印跡放入稀釋的熒光染料標記的二抗溶液中，輕柔搖動，孵育1小時。
2. 用清洗液清洗印跡3-5次，每次5分鐘。
3. 將印跡放在一張干凈的濾紙上干燥。
4. 如果使用薄膜包被，使用Mylar®膜。切勿使用Saran™保鮮膜，因為它允許光線透過，會淬滅熒光。
5. 利用適當的熒光掃描儀對印跡進行成像。

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