手冊的這一節(jié)是最常用的蛋白質(zhì)印跡操作的概要。這些方法是通用的，適用于所有市售的檢測試劑。它們可利用眾多技巧來優(yōu)化，包括本節(jié)中的技巧。這些優(yōu)化技巧是默克密理博公司多年來關(guān)于轉(zhuǎn)印膜和印跡經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，也來自參考文獻(xiàn)和客戶的反饋。

提示：乙醇或異丙醇可替代轉(zhuǎn)印緩沖液中的甲醇。
提示：轉(zhuǎn)印緩沖液中的SDS（最高0.05%）可提高轉(zhuǎn)移效率，但也有可能降低膜對蛋白的截留。
提示：預(yù)切好的Immobilon® 轉(zhuǎn)印膜與所有標(biāo)準(zhǔn)尺寸的迷你膠及常用的電泳系統(tǒng)兼容（第8和9頁的表）。
            建議 – 在槽轉(zhuǎn)印之前預(yù)冷轉(zhuǎn)印緩沖液。
提示：較厚的凝膠或較大的蛋白質(zhì)可能需要較長的轉(zhuǎn)印時(shí)間或增加場強(qiáng)。真正的轉(zhuǎn)印條件應(yīng)針對每個(gè)系統(tǒng)來優(yōu)化。
提示：轉(zhuǎn)印緩沖液中的甲醇（8-20%）降低蛋白從膜上的洗脫效率，但改善PVDF轉(zhuǎn)印膜的吸附。
提示：由于PVDF的疏水性質(zhì)，膜需要用醇類浸潤。
提示：Tris甘氨酸緩沖液會(huì)在N端測序中產(chǎn)生較高的背景。如果蛋白質(zhì)要通過Edman降解來測序，可使用CAPS或TBE緩沖液。
提示：在分析較小分子量的蛋白質(zhì)時(shí)，可用0.2 μm Immobilon®-PSQ轉(zhuǎn)印膜來替代0.45 μm Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜。
提示：在熒光檢測方法中使用0.45 μm Immobilon®-FL轉(zhuǎn)印膜

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印

操作1.1 電泳轉(zhuǎn)�。翰郏�濕）轉(zhuǎn)印

下列操作介紹了利用槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）轉(zhuǎn)移到Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜的標(biāo)準(zhǔn)步驟。關(guān)于更多信息，請查看您的槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)附帶的操作指南。

必需的設(shè)備和溶液

• 包含已分辨蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠。
• Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜，切成與凝膠相同的大�。◣в腥苯牵�以便定位）。
• 兩張Whatman® 3MM濾紙或類似產(chǎn)品，切成與凝膠相同的大小。
• 兩塊泡沫墊（例如，Scotch Brite® 墊）。
• 槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，可容納凝膠。
• 甲醇，100%
• Milli-Q® 水
• Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液：25 mM Tris堿、192 mM甘氨酸、10%（v/v）甲醇，pH 8.3；或CAPS緩沖液：10 mM 3-環(huán)己胺-1-丙磺酸（CAPS）、10%（v/v）甲醇，pH 11（用NaOH調(diào)整）。

注意：兩種緩沖液都制備成10X儲(chǔ)液，在使用前與甲醇混合。

準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備足夠的轉(zhuǎn)印緩沖液來裝滿轉(zhuǎn)印槽，以及另外200 mL來平衡凝膠和膜，并潤濕濾紙。
2. 從轉(zhuǎn)印夾中取出凝膠；切掉積層膠和點(diǎn)樣孔。
3. 將凝膠浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液中10至30分鐘。
4. 將濾紙浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液中至少30秒。
5. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印膜：
a. 將膜在甲醇中浸泡30秒。膜應(yīng)均勻地從不透明變成半透明。
b. 小心將膜放入Milli-Q® 水中，浸泡2分鐘。
c. 小心將膜放入轉(zhuǎn)印緩沖液中，至少平衡5分鐘。

轉(zhuǎn)印堆積層的組裝

1. 打開凝膠支架轉(zhuǎn)印夾。
切記：為了確保均勻的轉(zhuǎn)移，請?jiān)诙逊e層中每一層的表面小心滾動(dòng)移液管或攪拌棒，以去除氣泡。不要施加過大的壓力，以防止損壞膜和凝膠。
2. 將泡沫（纖維）墊放在卡盒的一側(cè)。
3. 將一張濾紙放在泡沫墊上。
4. 將凝膠放在濾紙上。
5. 將膜放在凝膠上。
6. 將第二張濾紙放在堆積層上。
7. 將第二個(gè)泡沫墊放在濾紙上。
8. 蓋上凝膠支架轉(zhuǎn)印夾。

完整的轉(zhuǎn)印堆積層應(yīng)如下所示：

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印

1. 將凝膠支架轉(zhuǎn)印夾放入轉(zhuǎn)印槽中，讓凝膠一側(cè)面對陰極（-），膜一側(cè)面對陽極（+）。
2. 在槽內(nèi)加入足夠量的緩沖液，以覆蓋轉(zhuǎn)印夾。
3. 將黑色陰極引線（-）插入轉(zhuǎn)印裝置的陰極插孔，將紅色陽極引線（+）插入陽極插孔。
4. 將陰極引線和陽極引線連接到相應(yīng)的功率輸出。
5. 如果有的話，根據(jù)制造商的指引設(shè)置轉(zhuǎn)印槽的冷卻裝置。
6. 開啟系統(tǒng)，以6-8 V/極間距離運(yùn)行1-2小時(shí)。按照轉(zhuǎn)印槽制造商的指引，并參考蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上（第16頁），了解優(yōu)化細(xì)節(jié)。
7. 在轉(zhuǎn)印完成后，從轉(zhuǎn)印槽中取出轉(zhuǎn)印夾。
8. 利用鑷子，小心拆卸轉(zhuǎn)印堆積層。

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