了解下列章節中提出的有關免疫檢測的概念，將有助于優化特定樣品的操作。

• 雙印跡

在Western印跡中避免非特異結合的一種新方法是由法國國家反興奮劑實驗室的Françoise Lasne博士開發的（Lasne，2001；Lasne，2003）。在研究重組人促紅細胞生成素（EPO）時，Lasne博士發現重組和天然的EPO有著不同的等電點（pI）。重組EPO的pI為4.42-5.11，而天然EPO的pI偏酸性，為3.92-4.42。然而，在轉印尿液樣品時，二抗的超高非特異結合（NSB）讓人難以區分重組和天然EPO。為了避免NSB，Lasne博士使用了“雙印跡”。在一抗與印跡蛋白結合后，抗體在酸性條件下被轉移到第二張Immobilon®-P膜。一抗從相應的抗原上釋放，并通過中間體轉移到第二張（雙印跡）膜上。當雙印跡膜與二抗雜交時，不存在其他的蛋白非特異結合，從而避免了背景問題。

“雙印跡”也被用于轉甲狀腺素蛋白的檢測，是檢測低濃度的血清或尿液蛋白的有用方法。

• 檢測底物

現代的免疫檢測方法是基于酶連檢測，利用與酶共價結合的二抗，如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）。結合在二抗上的酶催化特異底物的降解，產生信號。通常使用三種類型的底物：顯色、化學發光和化學熒光，以及用熒光基團標記的二抗來檢測。Immobilon® PVDF膜經過檢測，可與所有市售的化學和化學發光底物兼容。

顯色檢測

顯色檢測（圖14）利用結合的酶來催化反應，使得不溶性的有色沉淀物沉積，例如，不溶的藍色化合物通過5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氮藍四唑鹽（NBT）的相互作用獲得的（Leary等，1983）。這種技術很容易開展，不需要特殊的設備。不過，以下應牢記：

• 顯色檢測的靈敏度通常至少比化學發光試劑低一個數量級。
• 沉淀物的產生可能干擾酶活并限制靈敏度。
• 沉淀物難以從膜上剝離，限制印跡再次用于其他蛋白質的檢測。

圖14. 利用顯色底物BCIP/NBT（KPL）對人血清中的轉鐵蛋白進行免疫檢測。從左到右，5 μL人血清稀釋物1:1,000、1:5,000、1:25,000、1:125,000。電轉的蛋白與山羊抗人轉鐵蛋白（1:10,000稀釋度）和AP結合的兔抗山羊IgG（1:30,000稀釋度）雜交。

化學發光檢測

化學發光檢測利用結合的酶來催化反應，使可見光產生。一些化學發光的系統是基于過氧化物的形成，通過辣根過氧化物酶；其他系統利用1,2-二氧雜環丁烷和堿性磷酸酶（Cortese，2002）。這種技術有著顯色檢測的速度和安全性，且靈敏度水平與放射性檢測相當。檢測可通過曝光到X射線膠片來實現，或直接在與化學發光兼容的數字成像系統上獲取圖像，它通常帶有高冷卻型CCD照相機，以避免電子噪音。化學發光底物可實現再次雜交。

目前有多種化學發光底物，為研究人員提供了不同的檢測靈敏度。傳統或低靈敏度的底物實現了皮克水平的蛋白檢測。盡管這些底物適合常規應用，但它們無法檢測低豐度蛋白。新的高靈敏度底物，如Luminata™ HRP底物，實現了飛克水平的蛋白觀察。不過，在使用這些強大的底物時，往往需要優化一抗和二抗的濃度（圖13，第29頁）。從低靈敏度底物轉換到高靈敏度底物（如Luminata™ Forte試劑）時，建議提高抗體稀釋度，以避免背景過高和非特異條帶的出現。

ECL免疫檢測的試劑可利用對-碘苯酚（PIP）和魯米諾（luminol）來制備（Hengen，1997）。PIP作為過氧化物酶對魯米諾活性的輔助因子，是增強可見光反應所必需的。在苯酚增強劑與HRP共同使用時，光水平約提高100倍（Van Dyke和Van Dyke，1990）。這些自制的試劑被大量引用，產生出色的結果，但最高純度的魯米諾和PIP是關鍵（Hengen，1997）。

熒光檢測

熒光檢測采用與熒光基團結合的抗體或熒光底物，后者在酶活性的位點發出熒光（化學熒光）。這種方法的一個優點在于，熒光信號在長時間內保持穩定，印跡可保存并再次照相。此外，廣泛的熒光基團讓您能夠同時檢測單個樣品中的多個目標蛋白（多重檢測）。直到最近，Western印跡中的熒光檢測仍受到大部分轉印膜高熒光背景的限制。與其他轉印膜相比，Immobilon®-FL轉印膜在廣泛的激發/發射波長下表現出低的背景熒光（圖15）。這種膜特別適合涉及到熒光免疫檢測的應用，包括化學熒光底物和多重分析（圖16）。此外，Immobilon®-FL膜也可用于傳統的化學發光或顯色檢測。

圖15. 負片影像顯示各種印跡膜上人血清中轉鐵蛋白的熒光檢測。血清稀釋度為：1:4,000、1:8,000、1:16,000、1:32,000、1:64,000。

圖16. 大腸桿菌細胞裂解液中過表達GST蛋白（帶cMyc或HA標簽）連續稀釋物的Western印跡。(A) cMyc標簽以一抗以及Qdot® 705（偽藍色）抗小鼠結合物檢測；(B) GST以Qdot 565（綠色）抗GST結合物檢測；(C) HA標簽以一抗以及Qdot® 605（紅色）抗小鼠結合物檢測；(D) 印跡與三種抗體的組合雜交（多重分析）。印跡在柯達成像儀上掃描。數據由Quantum Dot公司提供。

• 再次雜交Immobilon® PVDF轉印膜

通過從印跡上剝離第一個抗體，并與另一個孵育，單個印跡能夠依次與多個抗體進行分析。這對于共定位實驗和方法優化或樣品量有限時特別有用。

剝離過程破壞抗原抗體的鍵，將抗體溶解在周圍的緩沖液中。這通常是通過去污劑和加熱的組合或暴露在低pH下來實現的。這兩種方法都不能去除顯色檢測系統所產生的有色沉淀物（如BCIP、4CN、DAB和TMB）。不過，仍然能用特異針對另一種目標蛋白的抗體來分析印跡。

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