生物通報道：多年來，跟蹤一個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，超出了我們的能力。但是現(xiàn)在，時代已經(jīng)變了，新的單細(xì)胞RNA-seq方法，可以分析大量的細(xì)胞及它們的命運(yùn)。

我們都參加過大型生日派對：在擁擠的房間里，與許多人聊天、吃飯和慶祝。但是，試想你并不知道壽星是誰，只是像一個局外者看待這個派對。你可能會覺得整個事件看起來與其他的生日派對沒有什么不同。然而，派對上的每個人都在壽星的生活故事里擔(dān)當(dāng)獨(dú)特的角色。所以，如果不知道每位來賓和他們的角色，一個局外人可能就會做出錯誤的假設(shè)，或錯認(rèn)聚會上的人。

復(fù)雜器官的細(xì)胞成分，有點(diǎn)類似于生日派對。細(xì)胞群體在特定的時刻聚在一起，執(zhí)行關(guān)鍵的功能，形成一種器官。細(xì)胞亞群以不同的方式起作用，在特定的時間點(diǎn)履行專門的職責(zé)。（如同在聚會上，不同的人帶來禮物、吃食或幫助安排活動）。從技術(shù)的角度來看，仔細(xì)分析這些細(xì)胞如何單獨(dú)起作用，制造一個器官，為研究人員帶來了巨大的挑戰(zhàn)。但是，隨著科學(xué)家們不斷設(shè)計出的巧妙新技術(shù)，梳理每個細(xì)胞在許多復(fù)雜過程中所起的作用，這些挑戰(zhàn)都會逐漸消失。

一系列事件
當(dāng)進(jìn)入一個生日聚會時，大多數(shù)人所做的第一件事情就是，簡單的觀察，跟來賓交談。他們是誰？他們做什么？他們來自哪里？他們認(rèn)識壽星多久了？

在解決“單個細(xì)胞如何在復(fù)雜系統(tǒng)中起作用”的過程中，科學(xué)家采取了相似的路徑。他們選擇單個細(xì)胞并孤立地研究它們。然而，分離單個細(xì)胞進(jìn)行分子分析，非常棘手，而接下來的問題是，一旦分離出它們之后，如何研究它們？那就是，測定特定時刻每個細(xì)胞正在制造的RNA轉(zhuǎn)錄本，對正在發(fā)生的事情獲得一個快照。有了足夠多的快照，就有可能漸漸弄清復(fù)雜的細(xì)胞事件和不同生物學(xué)過程所需的時間。

單細(xì)胞RNA測序（RNA-seq），是從2008年高通量測序變革陰影中出現(xiàn)的新一代測序（NGS）應(yīng)用，當(dāng)時有幾個實驗室報道了測定生物學(xué)樣本RNA含量的不同方法。在過去的六年中，RNA-seq已經(jīng)給我們展示了RNA世界的驚人多樣性，從我們已經(jīng)知道的轉(zhuǎn)錄合成蛋白質(zhì)的mRNA，到在細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA。相關(guān)閱讀：利用RNA-seq研究非模式生物。

早期的RNA-seq研究主要集中在細(xì)胞群體，在細(xì)胞周期不同時間點(diǎn)的細(xì)胞混合物，對其進(jìn)行測序，以確定正在表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄本。而這些轉(zhuǎn)錄譜能提供已知的和新的RNA目錄，這一信息可告訴你參加聚會的賓客名單。這是一個很好的開始，但沒有提供你可能會喜歡的詳盡細(xì)節(jié)。

時間就是一切
哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的再生生物學(xué)和干細(xì)胞助理教授John Rinn，致力于探索RNA世界。他已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些新的功能性非編碼RNA（ncRNA），ncRNA一度被認(rèn)為是跟轉(zhuǎn)錄噪聲差不多的分子。

長非編碼RNA（LncRNA，例如XIST）是一類專門的RNA，其生物學(xué)作用最近才開始為人所了解。Rinn稱：“我們可以利用單細(xì)胞測序，進(jìn)一步了解XIST的功能。”

在2012年，Rinn的研究小組開始尋找更多功能形式的長非編碼RNA，特別尋找充當(dāng)強(qiáng)大細(xì)胞調(diào)控因子的RNA。為此，他和同事們應(yīng)用單細(xì)胞RNA-seq，來檢測細(xì)胞分化這類過程中基因轉(zhuǎn)錄的pseudotemporal動力學(xué)。通過編目所有的細(xì)胞RNA，連同它們在細(xì)胞中的出現(xiàn)和消失時間，Rinn希望找到一些有趣的新lncRNA，他能夠?qū)⑻囟ǖ墓δ軞w因于這些新lncRNA。但是，很奇怪的事情發(fā)生了：他發(fā)現(xiàn)了無聊的舊mRNA。

Rinn將這些結(jié)果發(fā)表在今年3月份的《Nature Biotechnology》雜志，介紹了肌細(xì)胞生成的6種新細(xì)胞調(diào)控因子，他解釋說：“細(xì)胞沒有定義明確的mRNA表達(dá)模式，它不像‘現(xiàn)在打開’和‘關(guān)閉’那么簡單。”然而，對Rinn來說最大的驚喜可能就是，他在數(shù)據(jù)中觀察到了基因表達(dá)的隨機(jī)性，相當(dāng)于在生日聚會上不斷來去的人們，每一分鐘都在改變著房間的動態(tài)。你如何捕捉所有這些變化并分析這些數(shù)據(jù)呢？

隨機(jī)性總是為生物學(xué)家?guī)�來挑�?zhàn)。在這種情況下，在單個細(xì)胞之間基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯示出非常高程度的可變性。生物學(xué)變化不是唯一的問題——Rinn也需要考慮測序文庫制備過程中的實驗可變性。但是可變性也提出了可能性。

Rinn指出：“實際上，可變性和多樣性會告訴你調(diào)控因子在哪里。”想象一個調(diào)控因子不受可變性的影響——這會產(chǎn)生更多的數(shù)據(jù)可信性。他們的解決方案是，開發(fā)一種無人監(jiān)督的聚類算法，稱為Monocle，能夠提高單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)的時間分辨率，并處理基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的變化。利用Monocle的分類方法，Rinn能夠找到六種新的肌細(xì)胞生成調(diào)控因子，同時解釋數(shù)據(jù)集中的實驗和生物學(xué)變化。

諸如Monocle的程序的出現(xiàn)，最終會為研究人員提供一種途徑，以一種有意義的方式，檢測生物學(xué)過程的基因表達(dá)動力學(xué)，使他們能理解來自RNA-seq轉(zhuǎn)錄本目錄的所有數(shù)據(jù)，較全面地了解細(xì)胞動力學(xué)。

準(zhǔn)備一個大型聚會
當(dāng)研究很少數(shù)的細(xì)胞時，用今天的測序技術(shù)和分析平臺，去確定在轉(zhuǎn)錄級聯(lián)早期或晚期階段中正在打開的是什么，是一個相當(dāng)簡單的實驗。但是，怎樣處理較大數(shù)量的細(xì)胞，獲得更詳細(xì)的信息呢？

通過在小型生日聚會上與別人交談，可以了解更多關(guān)于壽星的事情。然而，這不難看出，隨著聚會越來越大，很難發(fā)現(xiàn)那些相同的模式、趨勢和信息。如果你只跟一小部分的客人交談，如果偶然他們告訴我們關(guān)于壽星的完全不同的故事、給我們的信息太少，以至于不能建立聯(lián)系并得出結(jié)論，會發(fā)生什么情況？顯而易見的答案是，我們需要跟更多的人交談。在單細(xì)胞分析中同樣如此。

Rinn說：“用200個細(xì)胞，你開始了解情況。但是原則上，你采用的細(xì)胞越多，分辨率就越高。”分析幾百個單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組的實驗，即使用今天的測序系統(tǒng)，工作量也很大，這還不考慮數(shù)據(jù)分析在內(nèi)。

魏茨曼研究所免疫系的Ido Amit面臨著這種情況。測定有限數(shù)量細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，特別是那些已經(jīng)用特殊細(xì)胞標(biāo)記分離出來的細(xì)胞，因此，這對復(fù)雜的細(xì)胞過程和每個細(xì)胞所起的作用，只能提供有限的認(rèn)識。此外，需要公正的信息來了解從每個分析的細(xì)胞所獲得的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄譜。

為了解決這個通量限制，產(chǎn)生較高容量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，Amit及其同事開發(fā)出一種大規(guī)模并行RNA-seq工作流程，能夠同時破譯數(shù)百甚至數(shù)千個轉(zhuǎn)錄組，而不需要特定的標(biāo)記，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在今年4月份的《Science》雜志。這一工作流程的關(guān)鍵是，能夠收集單細(xì)胞樣本，然后barcode和多重RNA-seq反應(yīng)。

最初，通過熒光激活的細(xì)胞分選（FACS）將單個細(xì)胞分類到384孔板中。然后，利用標(biāo)記的材料和三個級別的barcoding，集中處理細(xì)胞。Amit研究小組利用該工作流程，能夠測定4000多個小鼠脾臟的單細(xì)胞RNA，這些細(xì)胞被濃縮用于表達(dá)CD11c表面標(biāo)記。多路復(fù)用實驗可讓1536個細(xì)胞在一個單軌道進(jìn)行測序，在來自每個細(xì)胞的200和1500種不同RNA分子之間，產(chǎn)生22000個對齊的讀長（reads）。類似于Rinn的發(fā)現(xiàn)，Amit的數(shù)據(jù)也顯示大量基因的高度細(xì)胞變異，這明確表明，檢測的脾臟細(xì)胞群具有異質(zhì)性，并且有機(jī)會發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控因子和通路。

近年來，RNA-seq方法和分析工具有了很大的提高，這使得單細(xì)胞分析不僅能表明變異存在，也為研究人員提供了一種方法，來了解這一轉(zhuǎn)錄變異背后的生物學(xué)意義。

（生物通：王英）

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