免疫檢測

免疫檢測利用特異抗體來檢測和定位印在膜上的蛋白質(zhì)（圖11）�？乖�-抗體結(jié)合的特異性實現(xiàn)了復雜樣品中單個蛋白的鑒定。

在開發(fā)一種新的免疫檢測操作時，所有成分及它們的相互作用都必須考慮。抗體濃度、緩沖液組成、封閉液和孵育時間必須根據(jù)經(jīng)驗來試驗，以確定最佳的條件。水的質(zhì)量對所有步驟都很重要 – 少量雜質(zhì)可能引起大問題。例如，辣根過氧化物酶的酶活性會被一種即使高純水也可能有的常見的污染物——熱原所抑制，也會被一種常用的抗體溶液防腐劑——疊氮化物所抑制。因為涉及一致性和污染物等問題，封閉液的質(zhì)量也必須認真考慮。

圖11. 基于膜的免疫檢測。

標準 vs. 快速的免疫檢測步驟

目前有兩種免疫檢測的操作：標準和快速。

標準免疫檢測方法包括下列步驟：
1. 封閉轉(zhuǎn)印膜上未被占據(jù)的位點，以防止抗體的非特異結(jié)合。
2. 將轉(zhuǎn)印膜與一抗共同孵育，一抗與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。
3. 清洗以去除未結(jié)合的一抗。
4. 將轉(zhuǎn)印膜與二抗結(jié)合物共同孵育，二抗與一抗結(jié)合。
5. 清洗以去除未結(jié)合的二抗。
6. 將轉(zhuǎn)印膜與底物共同孵育，底物與二抗結(jié)合物相互作用，從而顯示蛋白質(zhì)的位置。

快速免疫檢測省去了封閉步驟，縮短了清洗和孵育步驟所需的時間�？焖倜庖邫z測方法適合快速觀察豐度較高的蛋白質(zhì)。不過，標準免疫檢測提供了更高的靈敏度，并且對于新的樣品類型來說需要的優(yōu)化較少。標準和快速免疫檢測方法的操作都在操作3中列出。表6比較了開展兩種操作所需的時間。

表6. 標準 vs. 快速免疫檢測。