生物通報道：2014年12月5日，華人女學者、哈佛大學公共衛(wèi)生學院Dana-Farber癌癥研究所劉小樂（X Shirley Liu）博士帶領的研究小組，在國際著名學術期刊《Genome Biology》發(fā)表了一項最新生物信息學研究成果，題為“MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens”。在這項研究中，研究人員開發(fā)出一種統(tǒng)計方法，被稱為基于模型的全基因組CRISPR/Cas9敲除分析（MAGeCK），來確定來自于CRISPR/Cas9篩選的必需sgRNA、基因和通路。

本文通訊作者劉小樂博士，青年時代就讀于天津南開中學, 1992 年考入北京大學生物系。1994 年轉學到美國史密斯女子學院雙修生物化學和計算機科學, 三年后以最高拉丁榮譽畢業(yè)。2002 年于斯坦福大學取得生物醫(yī)學信息學博士和計算機科學輔修博士學位后, 被直接聘為哈佛大學終身制助理教授。她目前擔任哈佛大學公共衛(wèi)生學院生物統(tǒng)計與計算生物學系的終身正教授、Dana-Farber 腫瘤研究所功能性癌癥表觀遺傳組學中心主任和同濟大學生物信息學系教授并****講座教授。研究工作側重于基因調控機制的生物信息和計算機生物學研究。發(fā)表論文多篇，其中19篇在Nature/Cell系列期刊。

成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列(CRISPR)/Cas9系統(tǒng)是用于哺乳動物基因組編輯的一種全新方法。在這個系統(tǒng)中，單導向RNAs（sgRNAs）指導Cas9核酸酶誘導DNA雙鏈在靶向基因組區(qū)域斷裂。sgRNAs的5’端包括大約20nt的核苷酸序列，與靶序列是互補的。當雙鏈斷裂被非同源末端連接（NHEJ）修復時，插入和缺乏就會高頻率地發(fā)生，從而有效地敲除靶基因組位點。

最近開發(fā)的一種慢病毒傳遞方式，已經(jīng)能夠創(chuàng)建基因組范圍的CRISPR/Cas9敲除（或GeCKO）文庫，靶定100到10000個基因。這些文庫可讓我們以一種劃算的方式，在哺乳動物細胞系上進行陰性和陽性篩選。在CRISPR/Cas9基因敲除篩選中，每個基因被幾個sgRNA靶定，攜帶不同基因敲除的突變體庫，可以通過高通量測序得以解決。

與其他功能缺失的篩選技術（如RNAi）相比，全基因組CRISPR/Cas9敲除技術顯示出更大的希望，因為它能夠在DNA水平敲除基因。然而，這些篩選所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，給計算分析提出了幾大挑戰(zhàn)。首先，研究往往沒有重復或者僅重復幾次，這必然需要一種適當?shù)慕y(tǒng)計模型來評估讀取數(shù)據(jù)的方差，并評估處理樣本和對照樣本之間對比的統(tǒng)計學意義。所觀察到的sgRNA豐度，在陰性和陽性篩選實驗中都是高度可變的，與一個泊松抽樣模型相比，它們都是過度分散的。（這種過度分散類似于其他高通量測序實驗的觀察結果，如RNA-seq）

第二，因為靶定相同基因的不同sgRNA有不同的特異性和敲除效率，因此需要一種強大的方法，在聚集來自于多個sgRNA的信息時能夠把這些因素考慮在內。第三，根據(jù)不同的篩選文庫和研究設計，CRISPR/Cas9敲除篩選實驗的讀取數(shù)據(jù)分布是不同的，因為陽性選擇往往產(chǎn)生一些sgRNA（總序列讀取占支配地位）。這需要對序列讀取進行強大的歸一化。

現(xiàn)有的幾種算法，雖然不是專門為CRISPR/Cas9敲除篩選設計，但是可以用來明確識別選擇的sgRNA或基因。例如，edgeR、DESeq、baySeq和NBPSeq是常用于差異性RNA-seq表達分析的算法。這些算法能夠評估CRISPR/Cas9敲除篩選中點擊數(shù)的統(tǒng)計學意義，盡管只是在sgRNA水平。

一些算法——旨在排列基因組規(guī)模短干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）篩選數(shù)據(jù)中的基因，也可以用于CRISPR/Cas9敲除篩選數(shù)據(jù)，包括RNAi Gene Enrichment Ranking (RIGER)和Redundant siRNA Activity (RSA)。然而，這些方法主要設計用以確定大多來自于寡核苷酸條碼微陣列數(shù)據(jù)的必需基因（essential gene），一種新的算法必須優(yōu)先考慮sgRNA，以及來自高通量測序數(shù)據(jù)的基因和通路。

在這項研究中，研究人員開發(fā)出一種統(tǒng)計方法，被稱為基于模型的全基因組CRISPR/Cas9敲除分析（MAGeCK），來確定來自于CRISPR/Cas9篩選的必需sgRNA、基因和通路。研究之所以用“essential”這個術語，指的是陰性或陽性選擇的sgRNAs、基因或通路。

與現(xiàn)有計算方法相比，MAGeCK的優(yōu)勢在于，它能控制錯誤發(fā)現(xiàn)率，而且它具有很高的靈敏度。MAGeCK的結果也對不同的測序深度和每個基因的sgRNA數(shù)目，有很強的穩(wěn)健性。此外，使用公共CRISPR/Cas9敲除篩選文庫，研究人員證明，MAGeCK能夠同時進行陽性和陰性選擇篩選，并確定具有生物學意義及細胞類型特異性的必需基因和通路。

（生物通：王英）

延伸閱讀：Science綜述：CRISPR-Cas9系統(tǒng)的歷史和未來

生物通推薦原文摘要：
MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens
Abstract: We propose the Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR/Cas9 Knockout (MAGeCK) method for prioritizing single-guide RNAs, genes and pathways in genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. MAGeCK demonstrates better performance compared with existing methods, identifies both positively- and negatively-selected genes simultaneously, and reports robust results across different experimental conditions. Using public datasets, MAGeCK identified novel essential genes and pathways, including EGFR in vemurafenib treated A375 cells harboring a BRAF mutation. MAGeCK also detected cell-type specific essential genes including BCR and ABL1 in the KBM7 cells bearing a BCR-ABL fusion, and IGF1R in the HL-60 cells, which depends on the insulin signaling pathway for proliferation.