生物通報道：重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司TwistDx Inc開發）。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。

RPA在臨床診斷領域的應用

艱難梭狀芽孢桿菌（C. difficile）是一種會引起感染性腹瀉的重要致病菌。日前，研究人員以這種致病菌的毒力基因tcdB為靶標，開發了一個低成本的微流體RPA平臺，文章發表在十月二十三日的《Analyst》雜志上。這個檢測C. difficile的RPA分析芯片只需要6.4 µL的初始樣本，能夠對擴增反應進行實時監控。（參考文獻：Real-time microfluidic recombinase polymerase amplification for the toxin B gene of Clostridium difficile on a SlipChip platform）

據估計，世界上約三分之一的人體內潛伏著結核�。�TB）的致病菌，這些致病菌大多在肺部處于休眠狀態。改善檢測方法幫助TB診斷，被WHO列為公共建康的首要問題之一。RPA作為一種常溫的快速DNA 擴增法，為資源匱乏的地區提供了檢測TB的簡便工具。研究人員在RPA的基礎上，快速檢測了結核分枝桿菌復合群MTC的DNA（IS6110 和IS1081）。在39°C的環境下，RPA檢測能在20分鐘內得出高靈敏度的結果。進一步研究表明，在檢測TB感染者的肺部樣本時，RPA檢測比熒光顯微鏡檢測還要準確。這項研究發表在今年八月份的《Plos one》雜志上。（參考文獻：Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis by Recombinase Polymerase Amplification）

抗生素濫用現象使耐藥菌日漸增多，目前這已經成為了一個全球性的公共健康問題。作為一種重要且危險的致病菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA一直是臨床治療中的棘手問題。在對MRSA進行DNA檢測的時候，引物只能靶標一個多變的染色體區域，SCCmec。今年七月的《Plos one》雜志上發表的一項研究，通過多重RPA反應篩查了726個MRSA分離物。研究人員通過二代測序發現，24個RPA未檢出的分離物中出現了新的插入突變，需要重新設計擴增引物。這一結果說明，臨床上的MRSA篩查不能完全依賴DNA檢測。（參考文獻：Recombinations in staphylococcal cassette chromosome mec elements compromise the molecular detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus.）

《Microchimica Acta》雜志今年二月的一項研究，展示了能夠同時擴增和檢測三種病原體的RPA芯片，包括淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門氏菌（Salmonella enterica）和MRSA。這種芯片可以在二十分鐘以內完成三種病原體和對照質粒的檢測，S. enterica和MRSA的檢出限可達10 CFU，N. gonorrhoeae的檢出限可達100 CFU。這項研究中的RPA芯片，有望成為實地篩查重要致病菌的簡便工具。（參考文獻Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens）（延伸閱讀：替代PCR，RPA在HIV檢測中大展身手）

RPA在食品安全領域的應用

產志賀毒素的大腸埃希菌STEC是世界范圍內最嚴重的一種食源性致病菌�！�FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE》雜志今年七月發表的一項研究，在RPA的基礎上首次建立了等溫實時的STEC檢測體系。研究人員設計并評估了一系列引物和熒光探針，實現了很高的特異性和靈敏度。（參考文獻：Real-time isothermal detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli using recombinase polymerase amplification.）

沙門氏菌是一種主要的食源性致病菌�！�Analytical Chemistry》雜志今年三月份發表的一項研究，將TwistFlow®沙門氏檢測整合到微流體裝置中，構建了檢測沙門氏菌DNA的一體化分析系統。這一微流體裝置整合了致病菌檢測的三個主要步驟（DNA提取、RPA擴增和結果檢測），能夠在三十分鐘內以全自動的方式完成檢測。人們可以直接通過側流層析試紙條看到沙門氏菌檢測的結果。研究顯示，這種裝置。對PBS和牛奶的檢測下限分別為10 CFU/ml和100 CFU/ml。（參考文獻：Fully Integrated Lab-on-a-Disc for Nucleic Acid Analysis of Food-Borne Pathogens）

PCR- ELISA已經是一個用途相當廣泛的成熟技術。《Analytica Chimica Acta》雜志今年二月發表的一項研究，首次用RPA取代了PCR，將快速的常溫擴增、生物素/鏈霉親和素體系、和比色法免疫分析結合起來。這種RPA-ELISA分析法可以用來篩查食品中的安全隱患，比如過敏原（榛子、花生、大豆、蕃茄和玉米）、轉基因成分（P35S和TNOS）、致病菌（Salmonella sp.和Cronobacter sp.）以及真菌（Fusarium sp.）。這項研究顯示，RPA-ELISA在上述應用中均得到了令人滿意的結果，有著很高的靈敏度和可重復性。（參考文獻：Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.）

生物通編輯：葉予